группа компаний «ВИВАРИЙ»
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ВЗЯТИЯ ПРОБ КРОВИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ КРЫС
Иванова Дарья Юрьевна
студент 3 курса, факультета ветеринарной медицины ОмГАУ, г. Омск
Научный руководитель Хониниа Глина Васильевна
канд. ветеринарных наук, доцент ОмГАУ, г. Омск
Научный руководитель Выставной Александр Леонидович
канд. ветеринарных наук, доцент ОмГАУ, г. Омск
Крысы являются одним из самых популярных видов животных, применяемых для разного рода лабораторных испытаний и исследований. Использование их организма в качестве биологической модели обусловлено рядом факторов, например, таких как высокая плодовитость, относительно короткий срок онтогенеза, неприхотливость в содержании, а также тот факт, что геном крысы и человека имеют 90% общих генов. Кроме того, крысы имеют большую физиологическую схожесть с человеком, нежели их главные конкуренты мыши [8].
Для исследовательских целей на данный момент существует большое количество линий разведения крыс. Таких животных отличает склонность к определённым патологиям, реакция на воздействие того или иного фактора либо другие программируемые параметры. Использование линейных животных позволяет в приемлемые сроки выявить определённый стандартный ответ организма животного на факторы воздействия.
При оценке результатов исследования используют большое количество показателей состояния организма крысы. Благодаря техническому прогрессу, методы исследования организма животного имеют широчайший спектр, однако большинство испытаний не обходится без анализа крови. Анализ крови позволяет наиболее точно составить общую картину морфологического и функционального состояния тканей, органов и систем организма. В этой связи особо остро стоит вопрос о точности и достоверности данного анализа. Большую роль здесь играет метод забора крови. Главными рисками, влекущими искажение данных, являются применение препаратов для анестезии и средств, вызывающих гиперемию, посторонние биологические жидкости (например, при декапитации), попадание микрофлоры и т.д. Важно иметь в виду, что каждый организм и процессы, протекающие в нём, уникальны. Поэтому авторам представляется весьма важным использование проб крови в течение эксперимента от одних и тех же животных. Информация мониторинга показателей крови в таком случае будет наиболее информативна и достоверна.
При взятии крови необходимо учитывать, что в разных участках тела (хвост и тушка) количество форменных элементов крови значительно разнится, поэтому следует брать кровь в течение всего эксперимента из одного и того же сосуда или группы сосудов, приблизительно в одно и то же время, как правило, натощак. Повторное взятие крови у лабораторных животных для общего анализа крови следует производить не чаще чем через 2 недели, особенно в случае неспецифического воздействия химических веществ [5, с. 25].
С целью выбора наиболее подходящего метода забора крови для анализа нами были рассмотрены на практике и проанализированы существующие на данный момент в лабораторной практике методы взятия крови у крыс. Прежде всего стоит сказать, что методы взятия крови по отношению к применению анестезии (наркоза) принято подразделять на методы взятия крови, не требующие наркоза, и методы взятия крови, требующие наркоза.
Также методы взятия крови принято подразделять на терминальные (тотальные) и нетерминальные. При терминальном заборе крови происходит тотальное обескровливание животного, а при нетерминальном жизнь животному сохраняют. Как правило это деление весьма условно и во многом зависит от целей исследования и от требуемого объёма крови, хотя и существуют строго терминальные методы, например, пункция каудальной полой вены или брюшной аорты. Для более точной оценки результатов исследования, по мнению авторов, всё же следует производить мониторинг показателей крови одного и того же животного на протяжении всех этапов эксперимента, тем более, что для современных биохимических анализаторов требуется очень малое количество сыворотки крови, измеряемое в микролитрах.
К методам, не требующим наркоза относятся взятие крови:
1.путём надреза кончика уха;
2.путём прокола или надреза лап по Г.В. Фёдорову;
3.путём надреза десны по В.H. Зильфяну и В.А. Кумкумджяну;
4.путём надреза хвоста;
5.путём пункции вены хвоста (v. caudalis);
6.путём пункции латеральной вены сафена (v. saphenalateralis/parva);
7.путём пункции дорсальной вены стопы (v. dorsalispedis).
Из ушных раковин у крыс или проколе подушечки лапы удается взять крайне небольшое количество крови (буквально 1-2 капли), а повторные заборы возможны через 3-5 суток. Для предупреждения быстрого свертывания крови ушную раковину можно смазать тонким слоем парафина. При этом, как утверждают литературные данные, содержание эритроцитов, лейкоцитов и лейкоцитарная формула крови остается без изменений [6].
Сделав надрез лапы (кисти) у крыс можно получить около 1 мл крови. С этой целью лучше использовать пробирку с резиновой манжетой, где поддерживается отрицательное давление [6].
При взятии крови из десны необходимо туго собрать складку кожи на затылке крысы, чтобы создать условие венозного застоя крови в области головы. Затем десну обрабатывают ватным тампоном, чтобы удалить слюну, и совершают надрез между резцами. В образовавшемся кармане скапливается кровь, которую аккуратно собирают пипеткой. По словам авторов данной методики, показатели собранной таким образом крови не отличаются от результатов крови, полученной из вены хвоста. Однако, дынный факт вызывает сомнения, поскольку велик риск попадания слюны, частичек пищи и микрофлоры ротовой полости в пробы крови, что может отразиться на результатах исследования. Кроме того, подобным образом удалось получить лишь несколько капель крови.
Взятие крови из хвоста можно осуществить различными путями, исходя из требуемого объёма крови, необходимого для анализа. Для получения нескольких капель для изготовления мазка делают косой надрез кончика хвоста над просвечивающей веной на глубину 1-2 мм, предварительно обработав корень хвоста спиртом. Для получения малых объёмов можно использовать циркулярный надрез. При повторных взятиях крови надрезы производят на расстоянии 1-1,5 см от предыдущих по направлению к концу хвоста [4, с. 15].
В больших объёмах удаётся получить кровь путём пункции хвостовой вены. Перед взятием крови необходимо опустить хвост в тёплую +35°C (по некоторым данным в очень горячую 45-50°С) воду или натереть 70%-ым этиловым спиртом (ксилолом или толуолом), а затем сдавить вену у корня хвоста [7]. Для пункции применяют шприц или катетер-бабочку. Кровь насасывают, создавая небольшое отрицательное давление в шприце, чтобы избежать разрушения форменных элементов крови. Взятие крови из хвоста путём надреза и венепункции также относительно не влияет на содержание эритроцитов, лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови. К отрицательным моментам можно отнести тот факт, что зачастую при использовании данного метода травмируется нерв, проходящий в одном с веной нервно-сосудистом пучке, в результате чего на хвосте наблюдаются трофические язвы и участки некроза.
Взятии крови из вен тазовых конечностей (вена сафена, дорсальная вена стопы) приближено к таковому из вены хвоста. При неосторожном взятии крови таким образом на месте прокола может образоваться гематома, которая, однако, очень быстро проходит.
К методам, требующим наркоз относят взятие крови:
1.путём ампутация кончика хвоста;
2.из бедренной вены (v. femoralis);
3.из орбитальной пазухи по Г. Ребигеру;
4.путём пункции сердца;
5.из яремной вены (v. jugularisexterna);
6.путём декапитации;
7.взятие крови из задней полой вены (v. cavacaudalis);
8.взятие крови из брюшной аорты (pars abdominalis aortae).
При ампутации кончика хвоста кровь стекает в пробирку самотёком при условии, что хвост должен быть опущен вниз, т.е. находится ниже уровня тела животного. Также используя вакуум, можно получить большее количество крови. Недостатком является то, что при повторных взятиях крови увеличивается число лейкоцитов из-за развития воспалительной реакции, а также анестезия может отразится на биохимических показателях сыворотки крови.
Весьма трудоёмким является процесс взятия крови из яремной и бедренной вен у крыс. При взятии крови их приходится отпрепаровывать и вскрывать. Кровь накапливается в образовавшемся кармашке, откуда и осуществляется её забор. После взятия крови рану тампонируют и зашивают. По нашему мнению, такая процедура взятия крови имеет ряд недостатков таких, как сложность процедуры, возможность образования сгустка, гемолиз и пр.
Взятие крови из ретробульбарного синуса требует от исследователя большого опыта и мастерства. Таким путём можно получит 0,5-1 мл крови [2, с. 84-85]. Объём полученной крови можно увеличить путём натяжения кожи в области век, что приведёт к сдавливанию ярёмных вен. При условии взятия малого количества крови животное остаётся живым, при взятии больших объёмов, погибает от гиповолемии. Однако даже при взятии малых объёмов возможен неблагоприятный исход: крыса может получить травму глаза или ослепнуть. Недостатком является и то, что в пробу крови может попасть слёзная жидкость.
Пункцией сердца удается получить 3-5 мл, а по некоторым данным у крупных крыс до 6-8 мл крови [3, с. 291]. При проведении манипуляций необходимо строго соблюдать осторожность: стоит избегать прикосновения иглы к стенкам сердца, т.к. это может вызвать аритмию или остановку сердца у животного.
Если предполагается сохранение жизни животному, то количество крови не должно превышать допустимых значений. Так один раз в 24 часа можно отбирать до 1% объема циркулирующей крови. Для быстрого определения объема крови, который допустимо отбирать каждые 24 часа, используют формулу:
объем крови для взятия = 0,01 * объем циркулирующей крови (мл/день) (1)
Один раз в 3-4 недели можно отбирать до 10% объема циркулирующей крови, однако после этого необходимо ввести подкожно подогретый до температуры тела стерильный изотонический раствор хлорида натрия в том объёме, в котором была взята кровь, или глюкозу в количестве, равном двойному объему взятой крови. Для быстрого расчёта используют формулу:
объем крови для взятия = 0,1 * объем циркулирующей крови (мл/день) (2)
Однако восстановление полного кровяного состава происходит через 2-4 недели по 0,6 мл/кг в день. Поэтому всегда стоит помнить, что при взятии крови в больших объёмах слишком быстро без замещения, животное может испытать гиповолемический шок, который повлечёт смерть. При слишком частом взятии, у животного развивается анемия, а также искажаются показатели форменных элементов крови и её биохимического состава.
Как правило, объем циркулирующей крови составляет 55-70 мл/кг веса тела. Для крысы это 50-70 мл/кг. Стоит помнить, что у ожиревших и старых животных объем циркулирующей крови может быть меньше на 15%.
Взятии более чем 30% от полного циркулирующего объема крови, является терминальным в следствии гиповолемии. Подобное взятие крови выполняется, как правило, в конце исследования у наркотизированного животного или после эвтаназии [1, с. 23].
Подводя итоги исследования, авторы данной работы пришли к выводу, что наиболее удобным и достоверным методом, является метод взятия крови путём венепункции из вены сафена. Преимущества метода заключаются в том, что:
1) вена легко обнаруживается;
2) объём взятой крови достаточен (до 1 мл) для биохимического анализа сыворотки крови;
3) не происходит искажения биохимических показателей, т.к. не был использован наркоз;
4) не происходит гемолиз крови при взятии проб;
5) удобно для исследования большого количества животных;
6) животное можно использовать для продолжения эксперимента;
7) минимально травмирует животное и др.
Таким образом, применяя данный метод взятия крови, можно получать наиболее адекватные и достоверные результаты, которые позволят наиболее полно и точно сделать выводы об итогах исследования в условиях рациональной трудоёмкости и минимальных экономических затрат.
1. Богомолов А.Ф. Методические рекомендации по курсу экспериментальной физиологии для студентов биологического отделения биолого-химического факультета. Иваново: Изд-во Ивановский Государственный Универсистет, 2005. – 40с.
2. Дьякон А.В. Метод забора крови у животных // Фундаментальные и прикладные исследования в медицине. – 2013. — №11. – с. 84-85.
3. Каркищенко Н.Н. Альтернативы биомедицины. М.: РАМН, 2010. – 344с.
4. Красильщикова М.С. Руководство по работе с лабораторными животными для сотрудников ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России, занятых проведением доклинических. М.: Изд-во ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова, 2015. – 42с.
5. Метод терминального взятия больших объемов крови для лабораторных исследований у крыс и мышей // Некоммерческое Партнёрство «Объединение специалистов по работе с лабораторными животными»: сайт. URL: http://ruslasa.ru/wp-content/uploads/Terminalnyiy-zabor-krovi.doc (дата обращения 02.03.2016 г.)
6. Способы взятия крови у крыс // Ветеринария в сельском хозяйстве. [электронный ресурс] – Режим доступа. – URL: http://handcent.ru/laboratornye-zhivotnye/423-sposoby-vzyatiya-krovi-u-krys.html (дата обращения 02.03.2016 г.)
7. Сюрин В.Н. Методы лабораторной диагностики и вирусных болезней животных: справочник. М.: Агропромиздат, 1986. – 351с.
Источник
Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: крысы
Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии,
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор,
А.А. Зуева, токсиколог
АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»,
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245
Резюме
Установление корректных референсных интервалов для лабораторных показателей актуально как в клинической практике, так и при проведении исследований на животных. Проведен ретроспективный анализ данных по 11 биохимическим показателям сыворотки крови крыс на большой выборке животных (196 самцов и 184 самки крыс, в возрасте 12–20 нед, массой 250–350 г).
Установлено, что в крови крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), выбросы других показателей, существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при планировании исследований, что требует увеличения числа повторностей при проведении анализа показателей.
Установлены референсные интервалы для креатинина, мочевины, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глюкозы и общего билирубина. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (более 30%) установлена для таких показателей, как активность щелочной фосфатазы, уровень триглицеридов, глюкозы и общего билирубина.
Проведено сравнение полученных в ходе ретроспективного анализа данных с референсными интервалами биохимических показателей крови крыс различных линий из 3 крупных питомников (Charles River, Taconic и Envigo). Представленные в литературе референсные интервалы также свидетельствуют о высокой вариабельности активности ряда ферментов (в том числе щелочной фосфатазы), а также концентрации глюкозы, общего билирубина и триглицеридов в крови крыс. Рассчитанные нами референсные интервалы хорошо сопоставимы с данными, представленными в литературе.
Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительном использовании именно ретроспективного анализа данных, который позволяет получить более корректные референсные интервалы на большей выборке животных, без ущерба для этических принципов. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови крыс и человека демонстрирует наличие видовых различий, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.
Введение
Биохимический анализ крови – неотъемлемая часть доклинических исследований, проводимых на лабораторных животных. В большинстве случаев дизайн эксперимента предусматривает сравнение показателей животных из интактных и подопытных групп. Число животных в группе, как правило, не превышает 10, что, с точки зрения статистики, является малой выборкой [1]. Для заключения о наличии/отсутствии клинической значимости наблюдаемых отклонений необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов (РИ).
В клинической практике применяют несколько способов установления РИ. Классический подход – формирование референсной группы с применением строгих правил включения и исключения, обследование и последующий расчет РИ. Это является трудоемким и дорогостоящим процессом для медицинских учреждений, а в доклинических исследованиях еще и противоречит нормам биоэтики, так как для установления РИ в каждой половой или возрастной группе требуется не менее 120 наблюдений [2, 4]. Другой подход – апостериорный (ретроспективный) – позволяет использовать для расчета РИ результаты, ранее полученные в данной лаборатории, за определенный период времени. Также на практике прибегают к данным в справочной литературе, что в доклинических исследованиях оправдано при анализе новых или редко используемых показателей или экзотических видов лабораторных животных.
В связи с изложенным, цель нашей работы – установление референсных интервалов для основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и оценка частоты статистических выбросов для этих показателей. Для установления РИ был выбран ретроспективный метод, что позволило включить в массив данных большое число животных, не нарушая при этом биоэтические принципы. Крысы являются одним из самых востребованных тест-систем. Поэтому мы рассматриваем вопрос установления РИ биохимических показателей на примере этих животных.
Материал и методы
Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в период проведения текущих исследований с октября 2018 по октябрь 2019 г. В массив данных включали животных интактных групп из 26 исследований, возраст самцов и самок аутбредных крыс составлял 12–20 нед, масса тела – 250–350 г (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). В сформированном массиве находились данные, полученные ранее от 196 самцов и 184 самок крыс. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Испания) были рассчитаны следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов Вектор-Бест (Россия), остальные аналиты – с помощью наборов Bio Systems (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна Уитни и t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5•IQR)-(Q3+1,5•IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.
После исключения выбросов массивы данных были проанализированы на соответствие действующим в центре РИ. Последние были рассчитаны с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (20 голов – 10 самцов и 10 самок). Данные о доле статистических выбросов, в том числе «extremes», по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.
Доли статистических выбросов и отклонений от действующих РИ
Источник