Экспериментальное исследование физиологического механизма и генетических основ аудиогенной эпилепсии грызунов
Творческий коллектив:
Работа выполняется совместно с Институтом Биологии Гена РАН (д.б.н. Павлова Г.В., к.б.н. Ревищин А.В.), с Институтом высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (д.б.н. Саркисова К.Ю., д.б.н. Виноградова Л.В.), с Факультетом фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова (д.б.н. Кошелев В.Б.).
Работа выполняется при поддержке гранта РФФИ №15-04-01732, руководитель – И.Б. Федотова, «Генетическая модель патологии мозга: судорожная готовность, возможные механизмы и особенности поведения при аудиогенной эпилепсии грызунов».
Описание направления
Диагностика и лечение эпилепсии человека остается актуальной задачей невропатологии и психиатрии, а информация о механизмах эпилептогенеза необходима и для поиска новых противосудорожных средств. Устойчивые к противосудорожной терапии случаи эпилепсии человека часто связаны с генетическими нарушениями. В аспекте этой проблемы практически важно исследовать процесс эпилептогенеза у животных (мышей и крыс) с генетической предрасположенностью к развитию судорог. В линии крыс Крушинского-Молодкиной почти 100% животных реагируют на звук развернутым судорожным припадком, которые начинаются фазой быстрого бега, а заканчиваются генерализованными тоническими судорогами (см. рис.1). Селекцию крыс на признак «аудиогенные судороги» в 1947 г . начали Л.В. Крушинский, Л.Н. Молодкина и Д.А. Флесс. В популяции крыс Вистар, которая была исходной для этой селекции, эпилептиформные припадки в ответ на сильный звук развивались только у 10-15% особей. В линии Крушинского-Молодкиной (КМ) практически 100% крыс реагируют на сильный звук эпилептиформным припадком максимальной интенсивности.
О повышенной «чувствительности» к звуку крыс и мышей, проявляющейся в виде эплептиформных припадков, известно достаточно давно. Как показали многолетние исследования, развитие аудиогенного эпилептиформного припадка у грызунов обусловлено не только особенностями слуховых проводящих путей, но также и отклонениями в функции центральных отделов, причем не только относящихся к акустическому пути.
Приступы АЭ при воздействии сильного звукового раздражителя были также обнаружены и у грызунов других видов. В середине 1940-х годов АЭ была описана у мышей линии DBA/2J (Hall, 1947), спустя десятилетие — у мышей еще нескольких инбредных линий, а также у беспородных животных. В начале 1950-х годов удалось получить линию белых мышей, названную по фамилии авторов «Frings», которую почти через пятьдесят лет успешно использовали для идентификации гена mass-1 (Monogenic Audiogenic Seizure-susceptible gene). Выведена линия предрасположенных к АЭ хомячков, которая также служит предметом нейрохимического и нейроанатомического анализа (c основным вниманием к структурам четверохолмия) (Fuentes-Santamaría et al., 2005, 2008, Prieto-Martín et al., 2012).
В конце 1980 гг. линия крыс КМ была переведена в инбредное состояние. На основе популяции гибридов F2 от скрещивания нечувствительных к звуку крыс Вистар и крыс линии КМ в начале 2000 гг. была начата селекция двух новых линий — линии «0» (нечувствительной к действию звука) и линии «4» (с максимальной чувствительностью к звуку) (см. рис.2).
Среди существующих моделей линия КМ (Крушинского-Молодкиной) остается уникальной в силу своего инбредного статуса, а также из-за возможности сравнивать показатели крыс этой линии с таковыми двух новых линий, селекционируемых в лаборатории физиологии и генетики поведения, – «0» и «4». Новая линия «0» — выводится на отсутствие АП в ответ на звук. Линия «4» — обнаруживает высоко интенсивные АП, которые можно сопоставлять с таковыми линии КМ, определяя их сходства и различия, а также сравнивая поведение животных этой линии с линией «0», поскольку у них генетический фон значительно более сходен, чем у этих линий и исходной линией крыс КМ. Подобной триады линий в других лабораториях мира не существует.
Исследования аудиогенной эпилепсии электрофизиологическими, нейрохимическими и молекулярно-генетическими методами позволили создать схему распространения патологического возбуждения при провокации судорог сильным звуком у предрасположенных к аудимогенной эпилепсии животных (см. рис.3).
В настоящее время в лаборатории проводится сравнительное исследование особенностей аудиогенной эпилепсии и поведения крыс этих линий (с оценкой их тревожности, склонности к развитию депрессии, реакции на фармакологические агенты и др.). Исследуются также отдаленные влияния на аудиогенную эпилепсию и поведение после введения в неонатальный период ряда фармакологических препаратов, а также отдаленные эффекты других средовых воздействий. В таблице 1 приведен фрагмент одного из исследований, в котором было показано, что кормление крысы-матери (линий «4» и «0») в период беременности диетой с повышенным содержанием «метильных радикалов», назначение которой было усилить метилирование генома в период формирования мозга потомства (Poletaeva et al., 2014). Оказалось, что детеныши, рожденные этими самками, обнаружили во взрослом возрасте несколько более низкую предрасположенность к аудиогенной эпилепсии по сравнению с контрольными животными – у них была насколько ниже интенсивность эпилептического приступа и, а латентный период начала припадка – был более длинным. Такие исследования показывают перспективность анализа отдаленных последствий ранних воздействий на ЦНС крыс для выявления возможных механизмов развития судорог.
| Линия | Группа, число животных | Инт.судор. (усл.балл) в 3 мес | Инт.судор. (усл.балл) в 4.5 мес | ЛП припадка в 3 мес | ЛП припадка в 4.5 мес | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| «0» | МОД, 18 | 1,76±0.41 | 2,03±0,32* | 49,83±12,21 | 44,66±9,34 # | ||
| Контр,11 | 2.59±0.51 | 3.09±0.41 | 28,09±15,62 | 17,18±11,95 | |||
| «4» | МОД, 11 | 3.09±0.51 | 3,23 ±0,26 | 24,45±15,62 | 24,36±11,95 | ||
| Контр, 27 | 2.76±0.32 | 3.85±0.26 | 35,33±9,97 | 8,81±7,63 | |||
*-достоверно отличается от показателя контрольной группы Темы квалификационных работ бакалавров: Темы квалификационных работ магистров: Телефон: +7 (495) 939-28-37, Источник В работе на созданных молекулярно-генетических моделях выявлена ассоциация генотипа А2/А2 локуса TAG 1A гена рецептора дофамина второго типа крыс с повышенной аудиогенной чувствительностью и увеличением удельной площади базолатеральной группировки миндалевидного комплекса по сравнению с крысами А1/А1. Эпилепсия является одним из наиболее распространенных неврологических заболеваний, имеет сложный полигенный характер и осложнена тем, что 30% пациентов резистентны к фармакотерапии. В настоящее время известен очень небольшой список генов, единичные мутации которых приводят к эпилепсии [18]. Много неясного в этиологии и патогенезе этого заболевания. Поэтому понимание биологических механизмов патогенеза и фармакорезистентности эпилепсии является актуальной задачей биологической психиатрии, невозможной без использования экспериментальных моделей [8]. В отношении эпилепсии эта задача облегчается тем фактом, что патогенетические механизмы эпилепсии сходны как у человека, так и животных [9]. Крысы линии WAG/Rij являются инбредной линией с генетически детерминированной абсансной эпилепсией. Согласно новой гипотезе абсансная эпилепсия является кортико-таламическим типом эпилепсии [6]. Ранее было показано, что у 30% взрослых крыс линии WAG/Rij аудиогенная стимуляция вызывает конвульсивные судороги. Так как крысы линии WAG/Rij выявляют устойчивую спонтанную пик-волновую активность, то аудиогенная субпопуляция этих крыс — хорошая модель для исследования смешанной формы эпилепсии, которая является тяжелой клинической проблемой для лекарственной терапии [7]. Впервые с помощью метода ПЦР изучен полиморфизм рестрикционного локуса TAG1A гена рецептора дофамина D2 и варьирующих тандемных повторов гена переносчика дофамина [5]. В ранее проведенных исследованиях была показана ассоциация гена DRD2 с особенностями ЭЭГ и гематологическими показателями двух указанных субпопуляций крыс линии WAG/Rij [2].Целенаправленное скрещивание гомозиготных крыс этой линии позволило получить на кафедре морфологии и физиологии человека Башкирского госуниверситета две субпопуляции крыс линии WAG/Rij. Целью данной работы являлось выявление различий в аудиогенной чувствительности гомозиготных крыс линии WAG/Rij с генотипами А1/А1 и А2/А2 по локусу TAG 1A гена дофаминового рецептора второго типа (далее обозначены как А1А1 и А2А2) и изучение планиметрических характеристик миндалевидного комплекса мозга (МК) у указанных групп крыс. Всех использованных в работе половозрелых крыс (в возрасте шести месяцев, всего 200) содержали в стандартных условиях вивария, характеризующихся постоянством комнатной температуры (20 0 -22 0 )С и уровнем влажности. Еду и питье животные получали ad libitum. Аудиогенную чувствительность крыс определяли в специальной камере (60x60x60см) по методике [17], используя «звон ключей» («keys ringing»). Звуковой сигнал имел диапозон 13-85 kHz (максимум спектра 20-40 kHz) и среднюю интенсивность 50-60 dB с величиной пиков до 80-90 дБ. Стимульный раздражитель включал в себя ультразвуковую часть и был более эффективным для вызова большого судорожного припадка, чем звук звонка или гудка [17]. Он предъявлялся в течение 1,5 минут. Ответ на стимул оценивали по четырех — бальной шкале, следуя определенным объективным показателям реакции животного [10]. Общее количество крыс, подвергнутых тестированию на чувствительность к звуку, составляет 190 особей. Планиметрические исследования МК выполнены на 10 крысах — самцах половозрелового возраста. Головной мозг фиксировали в 10% кислом формалине, заливали в формалин, готовили фронтальные срезы. Структурно-количественные характеристики структур МК изучены на высокоинформативных срезах [4]. Фронтальные срезы толщиной 20 мкм были окрашены по методу Ниссля, изучены под микроскопом и использованы для приготовления фотографий с помощью цифровой камеры. Полученные изображения были введены в компьютер и с помощью программы JmageJ v.1.38x проведены измерения удельной площади структур МК, полученные результаты обработаны с помощью программы «Statistica 5,5». Процент животных группы А1А1, проявивших чувствительность к аудиогенной стимуляции формированием большого судорожного припадка в выборке из десяти поколений (общее количество — 78), составил 16 процентов. Среди крыс, группы А2А2, процент отреагировавших на звуковой стимул судорожным припадком оказался равным 80. Судороги, развивающиеся при действии сильного звука у лабораторных мышей и крыс, рассматриваются как модель эпилепсии человека и интенсивно исследуются в плане оценки роли генотипа в генезе этого явления [3]. При проведении планиметрических исследований измеряли абсолютные площади левого и правого полушария мозга, МК в левом и правом полушарии и его структур — дорсомедиального ядра и заднего кортикального ядра (входящих в состав его кортико-медиальной группировки) и комплекса латерального и базолатерального ядер (базолатеральная группа структур). Вычисляли удельные площади МК и его структур в полушариях мозга. Использовали критерий φ (фи) для обеспечения нормального распределения в получаемых вариационных рядах. Сравнение вариационных рядов проводили с помощью пакета программ «Statistica 5.5». Полученные результаты показали, что при сравнении удельных площадей исследованных структур МК у крыс А1А1 и А2А2, определяются значимые различия в удельной площади дорсомедиального ядра и комплекса ядер базолатеральной группы. Удельная площадь дорсомедиального ядра у крыс А1А1 различается в правом и левом полушарии мозга, т.е. имеет явление асимметрии. Между группами крыс А1А1 и А2А2 различий по удельной площади этого ядра не выявлено. Между двумя группами крыс (А1А1 и А2А2) обнаружены значимые различия в величине удельной площади комплекса базолатеральных ядер, удельная площадь, как в правом и левом полушариях больше у крыс А2А2. Результаты сравнения величины удельных площадей по этой структуре МК приведены в таблице. Таблица 1. Результаты статистического сравнения удельных площадей базолатерального комплекса миндалевидного комплекса мозга у двух субпопуляций крыс (группы А1А1 и А2А2). Источник
# — отличается от показателя контрольной группы при p Fedotova I.B. , Merzalov I.B., Perepelkina O.V., Pavlova G.V. Maternal methyl-enriched diet in rat reduced the audiogenic seizure proneness in progeny. // Pharm. Biochem. a Behav . 2014. Vol. 127. P. 21–26. Возможные темы выпускных работ бакалавра и магистра
версия для печати
of your page —> 
© 2021 Кафедра
Высшей нервной деятельности МГУ
Почтовый адрес:
119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12,
Биологический факультет МГУ.
Факс: +7 (495) 939-28-37,
заведующий кафедрой профессор Латанов Александр ВасильевичАудиогенная эпилепсия у крыс
