Биохимические показатели крови крысы

Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: крысы

Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии,
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор,
А.А. Зуева, токсиколог

АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»,

188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245

Резюме

Установление корректных референсных интервалов для лабораторных показателей актуально как в клинической практике, так и при проведении исследований на животных. Проведен ретроспективный анализ данных по 11 биохимическим показателям сыворотки крови крыс на большой выборке животных (196 самцов и 184 самки крыс, в возрасте 12–20 нед, массой 250–350 г).

Установлено, что в крови крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), выбросы других показателей, существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при планировании исследований, что требует увеличения числа повторностей при проведении анализа показателей.

Установлены референсные интервалы для креатинина, мочевины, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глюкозы и общего билирубина. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (более 30%) установлена для таких показателей, как активность щелочной фосфатазы, уровень триглицеридов, глюкозы и общего билирубина.

Проведено сравнение полученных в ходе ретроспективного анализа данных с референсными интервалами биохимических показателей крови крыс различных линий из 3 крупных питомников (Charles River, Taconic и Envigo). Представленные в литературе референсные интервалы также свидетельствуют о высокой вариабельности активности ряда ферментов (в том числе щелочной фосфатазы), а также концентрации глюкозы, общего билирубина и триглицеридов в крови крыс. Рассчитанные нами референсные интервалы хорошо сопоставимы с данными, представленными в литературе.

Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительном использовании именно ретроспективного анализа данных, который позволяет получить более корректные референсные интервалы на большей выборке животных, без ущерба для этических принципов. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови крыс и человека демонстрирует наличие видовых различий, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.

Введение

Биохимический анализ крови – неотъемлемая часть доклинических исследований, проводимых на лабораторных животных. В большинстве случаев дизайн эксперимента предусматривает сравнение показателей животных из интактных и подопытных групп. Число животных в группе, как правило, не превышает 10, что, с точки зрения статистики, является малой выборкой [1]. Для заключения о наличии/отсутствии клинической значимости наблюдаемых отклонений необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов (РИ).

В клинической практике применяют несколько способов установления РИ. Классический подход – формирование референсной группы с применением строгих правил включения и исключения, обследование и последующий расчет РИ. Это является трудоемким и дорогостоящим процессом для медицинских учреждений, а в доклинических исследованиях еще и противоречит нормам биоэтики, так как для установления РИ в каждой половой или возрастной группе требуется не менее 120 наблюдений [2, 4]. Другой подход – апостериорный (ретроспективный) – позволяет использовать для расчета РИ результаты, ранее полученные в данной лаборатории, за определенный период времени. Также на практике прибегают к данным в справочной литературе, что в доклинических исследованиях оправдано при анализе новых или редко используемых показателей или экзотических видов лабораторных животных.

В связи с изложенным, цель нашей работы – установление референсных интервалов для основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и оценка частоты статистических выбросов для этих показателей. Для установления РИ был выбран ретроспективный метод, что позволило включить в массив данных большое число животных, не нарушая при этом биоэтические принципы. Крысы являются одним из самых востребованных тест-систем. Поэтому мы рассматриваем вопрос установления РИ биохимических показателей на примере этих животных.

Материал и методы

Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в период проведения текущих исследований с октября 2018 по октябрь 2019 г. В массив данных включали животных интактных групп из 26 исследований, возраст самцов и самок аутбредных крыс составлял 12–20 нед, масса тела – 250–350 г (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). В сформированном массиве находились данные, полученные ранее от 196 самцов и 184 самок крыс. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Испания) были рассчитаны следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов Вектор-Бест (Россия), остальные аналиты – с помощью наборов Bio Systems (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна Уитни и t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5•IQR)-(Q3+1,5•IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.

После исключения выбросов массивы данных были проанализированы на соответствие действующим в центре РИ. Последние были рассчитаны с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (20 голов – 10 самцов и 10 самок). Данные о доле статистических выбросов, в том числе «extremes», по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.

Доли статистических выбросов и отклонений от действующих РИ

Источник

Колебания биохимических показателей при изменении гелиогеофизической обстановки

Р.Н. Павлова, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биологической и общей химии, ORCID 0000-0001-6906-5310,
А.А. Мурзина, старший научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории,
В.А. Дадали, доктор химических наук, профессор кафедры биологической и общей химии,
Е.А. Соколова, кандидат химических наук, доцент кафедры биологической и общей химии, ORCID 0000-0002-4860-7763

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова Минздрава России,

191015, Россия, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41

Резюме

Известно, что в процессе срочной и долговременной адаптации к факторам внешней среды, в первую очередь к гелиогеофизическим, наибольшим изменениям подвержены биохимические показатели, обеспечивающие гомеостаз. Одним из неучтенных факторов, влияющих на формирование ответной реакции биохимической системы (при стандартных условиях проведения эксперимента), является гелиофизическая обстановка. В дни резкого изменения гелиогеофизических параметров могут наблюдаться изменения величины биохимических показателей в контрольной группе и изменения характера ответной реакции биологической системы. Рассматриваются причины, вызывающие такие изменения в контрольной группе и ответную реакцию на воздействие в стандартных условиях эксперимента, приводится сравнение с предыдущими данными.

Представлен ретроспективный обзор собственных данных, полученных в период с 1975 по 2009 г. по колебаниям биохимических показателей при изменении гелиогеофизической обстановки. Рассмотрены данные, полученные в исследованиях ex vivo и in vivo; объектом исследования служил гомогенат мозга и гемолизат крови беспородных белых крыс. В ходе ретроспективного анализа было оценено влияние гелиогеофизической обстановки на активность супероксиддисмутазы гемолизата крови и общей аденозинтрифосфатазы мозга крыс, содержание небелковых SН-групп гемолизата крови. Проведен корреляционный анализ колебаний биохимических и гелиофизических показателей. В ходе исследования показано, что в периоды гелиофизических флуктуаций происходит не только изменение активности ферментов (супероксиддисмутазы гемолизата крови и аденозинтрифосфатазы головного мозга крыс), но и изменение характера ответной реакции на физическое или химическое воздействие – появление разнонаправленной ответной реакции на воздействие фактора при тех же (кроме гелиофизической обстановки) условиях эксперимента. Появление в отдельные дни в серии биохимического эксперимента атипичного ответа может быть обусловлено космофизическими воздействиями, что доказывает сопряженность биохимических параметров с гелиогеофизической средой.

Введение

Важнейшим условием при исследовании действия любого рода факторов физической или химической природы на организм человека и животных является определение показателей в контрольной группе у здоровых. В настоящее время введена строгая стандартизация по отбору и условиям содержания животных контрольной и экспериментальной групп [1]. Однако имеются факторы, не поддающиеся стандартизации и контролю, в частности космофизические воздействия. Многочисленные исследования показали наличие корреляции между увеличением числа госпитализированных больных с разными заболеваниями, в первую очередь с сердечно-сосудистыми и нервно-психическими расстройствами, и другими патологиями, и колебаниями гелиофизических показателей. Возможность ответа биологических систем на гелиогеофизические факторы подтверждена в многочисленных исследованиях, результаты которых опубликованы [2–4].

В дни резкого изменения гелиогеофизических параметров может наблюдаться изменение биохимических параметров в контрольной группе, выраженность ответа или смена знака ответной реакции биологической системы на изучаемое воздействие. Однако, в связи со сложностью экспериментальной реализации задачи, работ, демонстрирующих не только количественное изменение показателей в период гелиофизических флуктуаций, но и смену знака ответной реакции, в цитируемых периодических изданиях практически нет. В нашей лаборатории проводились исследования, в которых удалось обнаружить смену знака, т.е. изменение характера ответной реакции биологического объекта, в частности активности ряда ферментов при изучении воздействия на них ряда физических и химических факторов в период выраженных гелиофизических флуктуаций.

Цель работы – анализ причин, вызывающих изменение величин показателей в контрольной группе и изменение ответной реакции на воздействие в стандартных условиях эксперимента по сравнению с предыдущими данными.

В статье представлен ретроспективный обзор собственных данных, полученных в период с 1975 по 2009 г. по колебаниям биохимических показателей при изменении гелиогеофизической обстановки.

Результаты и обсуждение

При исследовании активности АТФазы мозга крыс нами обнаружены значительные колебания показателя в контрольной группе животных (табл. 1).

Колебания активности АТФазы в гомогенатах мозга крыс и в эритроцитах барана в зависимости от гелиофизических флуктуаций

Месяц

Активность общей АТФазы мозга крыс (мкг Р/мг белка•ч)

Активность общей АТФазы эритроцитов барана (мкг Р/мг белка•ч)

ВПОУ

Число хромосферных вспышек

Примечание. ВПОУ – величина времени полуокисления унитиола.

В табл. 1 приведены резкие колебания активности общей АТФазы мозга крыс в разные месяцы 1975 г. Активность общей АТФазы нервной ткани определяли по скорости отщепления неорганического фосфора и выражали в мкг фосфора на мг белка в час. Активность АТФазы имеет хорошую корреляцию с числом хромосферных вспышек (ранговый коэффициент корреляции 0,91). Отметим, что изменения не носят сезонного характера так как в течение одного сезона (осень 1975 г.) активность фермента в сентябре и ноябре отличалась в 2,5 раза. В тот же период времени, Родионова Л.П. в другой лаборатории проводила определение активности АТФазы эритроцитов барана; колебания активности носили схожий характер [4]. Кроме того, приведены величины времени полуокисления унитиола – теста, характеризующего окислительно-восстановительное состояние среды, которое проявляется в конформационных изменениях биологических систем (см. табл. 1). Величина ВПОУ в тот период времени определялась ежедневно [2, 4].

Кроме изменений активности фермента в период гелиофизических флуктуаций в разные периоды 1975 г. имеет место изменение характера ответной реакции АТФазы на физическое воздействие – низкочастотное электромагнитное поле (ПеМП) частотой 0,5 гц, плотностью потока мощности 0,8.10 -3 мвт /см 3 , напряженностью поля в зоне однородности 2,1э. Время экспозиции гомогената мозга крыс в ПеМП – 6 ч при температуре 20˚С (табл. 2).

Изменение активности АТФазы мозга крыс в опытах ex vivo при действии низкочастотного электромагнитного поля (частота встречаемости эффекта)

Дата

Активация, %

Отсутствие эффекта, %

Ингибирование, %

Сентябрь, 1975 г.

Таким образом, нам удалось обнаружить, что в периоды гелиофизических флуктуаций происходит не только количественное изменение активности фермента, но меняется характер ответной реакции на физическое воздействие – появляется разнонаправленная ответная реакция на воздействие фактора при тех же (кроме гелиофизической обстановки) условиях эксперимента.

Другим примером изменения характера ответной реакции биологической системы на изучаемый фактор в период флуктуаций гелиогеофизических параметров является изменение знака ответа суперосиддисмутазы (СОД) и небелковых SH-групп крови крыс. В проведенных в январе 2009 г. опытах in vivo изучали изменения данных показателей на действие трансфер-фактора (пептидного комплекса с иммунотропными и адаптогенными свойствами), вводимого в дозе 0,07 мг/г интрагастрально в течение 10 дней до исследования [5]. При анализе результатов обнаружились выраженные колебания показателей антиоксидантной системы (АОС) у животных контрольной группы (ежедневно контрольная группа состояла из 3 животных) в период эксперимента: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатион-S-трансферазы и содержания белковых и небелковых SH-групп [6, 7]. Поэтому сопоставляли гелиофизические флуктуации с динамикой показателей АОС в период эксперимента. Активность СОД (у.е./мг белка) определяли определяли спектрофотометрически с квертицином [8], содержание SН-групп – методом амперометрического титрования [9].

Активность СОД, концентрация небелковых SH-групп крови крыс при действии трансфер-фактора и величины чисел Вольфа и К-индекса магнитного поля Земли в январе 2009 г.

Показатель/дата

19.01

20.01

21.01

23.01

26.01

27.01

28.01

СОД (у.е.) Контроль

СОД (у.е.) Трансфер-фактор

Небелковый SH-гр. (мкм/мл) Контроль

Небелк. SH-гр. Трансф. фактор

К-индекс геомагнитного поля Земли

Примечание. Представлены среднеарифметические величины и ± доверительный интервал; * – статистически значимые отличия при р0,05 (t-критерий Стьюдента).

В табл. 3 представлены средние величины показателей 3 животных, полученные в данный день, и величины гелиогеофизических параметров января 2009 г., цитированные по обзору состояния солнечной активности, ионосферы и магнитного поля Земли за январь 2009 г. данные предоставлены Новосибирским центром по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды для библиотеки Государственной геофизической обсерватории Санкт-Петербурга).

По этим данным 19.01.2009 имела место выраженная хромосферная вспышка. В предшествующую неделю величина чисел Вольфа была равна 0, величина К-индекса геомагнитного поля Земли колебалась в пределах 00000110–11210232. Согласно данным табл. 3, активность СОД в контроле через день после вспышки резко увеличилась, 21.01 и 23.01 трансфер-фактор снижал активность фермента, удерживая в пределах контроля предыдущих дней, однако 26.01 в ответ на действие трансфер-фактора в той же дозе произошла активация фермента.

Концентрация небелковых SH-групп гемолизата крови в контроле в период с 19.01.09 по 27.01.09 ежедневно снижалась, 20.01 и 21.01, действие трансфер-фактора приводило к повышению содержания SH-групп гемолизата крови, а 23.01 и 26.01 при тех же условиях эксперимента содержание небелковых SH-групп гемолизата крови в экспериментальной группе при действии трансфер-фактора снизилось по сравнению с контролем (см. рисунок).

Среди возможных механизмов формирования разнонаправленного ответа на действие факторов малой интенсивности важную роль играет исходное конформационное состояние молекулы белка, которое может меняться при действии ряда факторов и определять «поведение» белковой молекулы: изменения рН среды [10], изменения окислительно-восстановительного потенциала среды, в частности изменение тиолдисульфидного равновесия [2, 4], изменение липидного окружения мембранных ферментов [11], изменения гелиофизических параметров, в частности ряд биохимических показателей имеет четко выраженные суточные и сезонные колебания [12, 13].

В работе [14] показаны колебания активности АТФазы мышечной ткани, периодический ход которых обусловлен изменением концентраций конечных (или промежуточных) метаболитов, вызывающие конформационные перестройки в молекуле фермента, являющиеся причиной изменения ответной реакции.

Изменения рН среды, сопровождающиеся конформационными перестройками белковой молекулы, могут приводить к появлению иного типа ответа фермента, например ацетилхолинэстеразы на действие неорганических солей [10], или изменение ингибирования на активацию глутатион –S-трансферазы на действие солей желчных кислот [16].

Окислительно-восстановительный потенциал среды выполняет регуляторную функцию в клеточных процессах [2, 4]. Исследователи [15] установили, что при действии восстановителя имеет место повышение, а при действии окислителя – снижение активности АТФаз митохондрий мозга крыс. Очень часто не учитывают такой важный определяющий поведение мембранных белков фактор, как их липидное окружение [11].

При изменении гелиофизической ситуации в ряде случаев происходит окислительная модификация небелковых и белковых тиоловых групп, сопровождающаяся конформационными изменениями белков и ферментов и изменением их активности. Все эти факторы могут способствовать изменению характера ответной реакции биологического объекта на воздействие в условиях изменения гелиофизической обстановки и быть одной из причин, объясняющих наличие разного типа ответа при одинаковых воздействиях, что отмечалось разными авторами.

Вклад авторов: все авторы внесли существенный вклад в работу над статьей и несут ответственность за ее содержание.

Источник