Биохимия крови у крысы

Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: крысы

Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии,
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор,
А.А. Зуева, токсиколог

АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»,

188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245

Резюме

Установление корректных референсных интервалов для лабораторных показателей актуально как в клинической практике, так и при проведении исследований на животных. Проведен ретроспективный анализ данных по 11 биохимическим показателям сыворотки крови крыс на большой выборке животных (196 самцов и 184 самки крыс, в возрасте 12–20 нед, массой 250–350 г).

Установлено, что в крови крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), выбросы других показателей, существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при планировании исследований, что требует увеличения числа повторностей при проведении анализа показателей.

Установлены референсные интервалы для креатинина, мочевины, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глюкозы и общего билирубина. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (более 30%) установлена для таких показателей, как активность щелочной фосфатазы, уровень триглицеридов, глюкозы и общего билирубина.

Проведено сравнение полученных в ходе ретроспективного анализа данных с референсными интервалами биохимических показателей крови крыс различных линий из 3 крупных питомников (Charles River, Taconic и Envigo). Представленные в литературе референсные интервалы также свидетельствуют о высокой вариабельности активности ряда ферментов (в том числе щелочной фосфатазы), а также концентрации глюкозы, общего билирубина и триглицеридов в крови крыс. Рассчитанные нами референсные интервалы хорошо сопоставимы с данными, представленными в литературе.

Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительном использовании именно ретроспективного анализа данных, который позволяет получить более корректные референсные интервалы на большей выборке животных, без ущерба для этических принципов. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови крыс и человека демонстрирует наличие видовых различий, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.

Введение

Биохимический анализ крови – неотъемлемая часть доклинических исследований, проводимых на лабораторных животных. В большинстве случаев дизайн эксперимента предусматривает сравнение показателей животных из интактных и подопытных групп. Число животных в группе, как правило, не превышает 10, что, с точки зрения статистики, является малой выборкой [1]. Для заключения о наличии/отсутствии клинической значимости наблюдаемых отклонений необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов (РИ).

В клинической практике применяют несколько способов установления РИ. Классический подход – формирование референсной группы с применением строгих правил включения и исключения, обследование и последующий расчет РИ. Это является трудоемким и дорогостоящим процессом для медицинских учреждений, а в доклинических исследованиях еще и противоречит нормам биоэтики, так как для установления РИ в каждой половой или возрастной группе требуется не менее 120 наблюдений [2, 4]. Другой подход – апостериорный (ретроспективный) – позволяет использовать для расчета РИ результаты, ранее полученные в данной лаборатории, за определенный период времени. Также на практике прибегают к данным в справочной литературе, что в доклинических исследованиях оправдано при анализе новых или редко используемых показателей или экзотических видов лабораторных животных.

В связи с изложенным, цель нашей работы – установление референсных интервалов для основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и оценка частоты статистических выбросов для этих показателей. Для установления РИ был выбран ретроспективный метод, что позволило включить в массив данных большое число животных, не нарушая при этом биоэтические принципы. Крысы являются одним из самых востребованных тест-систем. Поэтому мы рассматриваем вопрос установления РИ биохимических показателей на примере этих животных.

Материал и методы

Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в период проведения текущих исследований с октября 2018 по октябрь 2019 г. В массив данных включали животных интактных групп из 26 исследований, возраст самцов и самок аутбредных крыс составлял 12–20 нед, масса тела – 250–350 г (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). В сформированном массиве находились данные, полученные ранее от 196 самцов и 184 самок крыс. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Испания) были рассчитаны следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов Вектор-Бест (Россия), остальные аналиты – с помощью наборов Bio Systems (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна Уитни и t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5•IQR)-(Q3+1,5•IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.

После исключения выбросов массивы данных были проанализированы на соответствие действующим в центре РИ. Последние были рассчитаны с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (20 голов – 10 самцов и 10 самок). Данные о доле статистических выбросов, в том числе «extremes», по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.

Доли статистических выбросов и отклонений от действующих РИ

Источник

Биохимия крови у крысы

В настоящее время используются различные модели атеросклеротического поражения стенки сосудов. Они могут быть вызваны самыми различными факторами: механическими, химическими, иммунологическими, а также диетой [7]. Модели на животных позволяют изучать не только стадии развития атеросклеротического процесса, начиная от самой ранней, но и возможности управления этим процессом. Наиболее популярной является модель экспериментальной гиперхолестеринемии, вызванной путем скармливания животным диеты с избыточным количеством холестерина и насыщенных жирных кислот [2, 3, 8].

У грызунов (мышей и крыс), в отличие от человека, в плазме крови отсутствует белок, переносящий эфиры холестерина с липопротеинов высокой плотности на липопротеины низкой и очень низкой плотности (cholesteryl ester transfer protein, CETP), и это является одной из главных причин их резистентности к развитию атеросклеротического процесса [15]. Отсутствие белка — передатчика эфиров холестерина не является единственным отличием метаболизма липопротеинов у грызунов по сравнению с человеком, грызуны имеют и другие особенности метаболизма липопротеинов: высокий уровень циркулирующих липаз [5] и специфичного белка — переносчика фосфолипидов (specific phospholipid transfer protein, PLTP) [10], что и объясняет их устойчивость к атеросклерозу. Однако у гипотиреоидных мышей и крыс эта устойчивость резко снижается, что позволяет получать информацию о факторах, способствующих развитию атеросклеротического процесса, а также о возможности разработки новых диагностических и терапевтических стратегий.

Цель исследования – изучение показателей липидного обмена и спектральных характеристик белкового состава липопротеинов плазмы крови у гипотиреоидных и эутиреоидных крыс на модели экспериментальной гиперхолестеринемии.

Материал и методы исследования

Эксперимент продолжительностью 68 сут выполнен на 18 крысах-самцах Вистар массой 390–560 г. Животных содержали в индивидуальных клетках, они имели свободный доступ к воде. Крысы I группы получали атерогенную диету (модель алиментарной гиперхолестеринемии): холестерин (Panreac Quimica SA, Испания) в дозе 25 мг/100 г массы тела, добавленный в стандартный лабораторный рацион. Крысы II группы получали ту же атерогенную диету и антитиреоидный препарат мерказолил («Акрихин», Россия) в дозе 1 мг/100 г массы тела, добавленные в стандартный лабораторный корм. Кормление животных происходило по схеме: один день – атерогенная диета (группа I) или атерогенная диета с добавлением мерказолила (группа II); второй день – голодание; вода ad libitum каждый день. Контрольную группу составили крысы, содержавшиеся в стандартных условиях вивария и получавшие стандартный рацион каждый день. В каждой группе было по 6 крыс, все животные дожили до конца эксперимента. В отношении экспериментальных животных были соблюдены все правила и рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах.

Показатели липидного обмена в плазме крови: общий холестерин (ОХС), холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП), холестерин фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ХС-ЛПНП + ХС-ЛПОНП), триглицериды (ТГ) определяли энзиматическим методом с использованием наборов «Biocon» (Германия) на биохимическом анализаторе «Labsystem» (Финляндия). Оценку тиреоидного статуса – концентрацию тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3), проводили иммунохемилюминесцентным методом с использованием наборов фирмы «Immunotech» (Чехия) на люминометре LM-01A (Bekman Coulter Company). Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) аполипопротеинов А-I и В (апоА-I и апоВ) выполняли непрямым методом, описанным нами ранее [4]. Индекс атерогенности рассчитывали как отношение (ОХС – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП, индекс Авогаро – как отношение концентрации апоА-I к концентрации апоВ (апоА-I/апоВ) [6].

Липопротеины выделяли из плазмы крови методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na2 на центрифуге «Optima L-90K» («Beckman Coulter») с использованием углового ротора 70.1 Ti при 105000 g в течение 24 ч [11]. Получали две основные фракции липопротеинов: ЛПОНП + ЛПНП (0,94 Примечания: * – p

Источник

Индекс атерогенности (ХС общий, ЛПВП) (венозная кровь) в Москве

Индекс атерогенности позволяет оценить баланс в обмене липидов. Исследование имеет особое значение для людей с повышенным сердечно-сосудистым риском.

Приём и исследование биоматериала

Комплексы с этим исследованием

• Антивозрастная диагностика в постменопаузе 12 630 Р
• Стресс-комплекс 4 310 Р
• Метаболический профиль 5 900 Р
• Расширенная антивозрастная диагностика в постменопаузе 29 230 Р
• Здоровый интерес 4 250 Р

Когда нужно сдавать анализ Индекс атерогенности (ХС общий, ЛПВП)?

1. Людям с повышенным уровнем холестерина согласно предыдущим анализам;
2. Для дополнительной оценки рисков со стороны сердечно-сосудистой системы;
3. Наличие клинических данных, свидетельствующих об атеросклерозе сосудов;
4. После перенесенного инфаркта миокарда/острого нарушения мозгового кровообращения.

Подробное описание исследования

Холестерин (ХС) представляет собой сложную молекулу, включающую липиды (жиры) и полициклический спирт. Это вещество необходимо для человека, поэтому синтезируется клетками печени. Кроме того, часть холестерина поступает при употреблении продуктов, в составе которых имеются жиры животного происхождения.

Потребность человека в холестерине продиктована его важной ролью во многих биологических процессах. Данное вещество служит субстратом для образования половых гормонов (как у женщин, так и у мужчин) и жёлчных кислот, участвует в обмене витамина D, формировании клеточных мембран.

Попадая в кровь, холестерин соединяется с особыми молекулами, — липопротеидами, в составе которых доставляется в органы и ткани, а также может транспортироваться из клеток обратно в печень. В зависимости от вида подобных соединений выделяют фракции холестерина, их совокупность обозначается как липидный спектр.

Липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) переносят холестерин в ткани, в том числе в артерии, что создает предпосылки для появления атеросклеротических бляшек. Ввиду этого ХС-ЛПНП часто обозначают как «плохой» или «вредный». Чем больше уровень ЛПНП, тем более высокий риск сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений: ишемической болезни сердца, инфаркта, нарушения мозгового кровообращения.

В противоположность ЛПНП, холестерин в составе липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП) относят к «хорошему» или «полезному». Преимущество ЛПВП заключается в том, что они переносят липиды из сосудов и органов обратно в печень. Достаточное содержание ЛПВП крайне важно для поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы.

Во избежание развития атеросклероза соотношение между содержанием общего холестерина и ЛПВП должно поддерживаться на определенном уровне. Такой показатель называют индексом/коэффициентом атерогенности (КА).

Повышенный индекс атерогенности означает, что в обмене жиров у обследуемого человека наблюдается дисбаланс с преобладанием фракции «вредного» холестерина. Низкий КА связан с достаточным присутствием ХС-ЛПВП в организме. Следует отметить, что причину выявленных изменений анализ не показывает.

Исследование служит дополнением к стандартному биохимическому анализу крови. Оно может рассматриваться как один из базового и легкодоступных инструментов прогнозирования сердечно-сосудистого риска. Используя полученные данные, врач примет решение о том, следует ли понижать уровень холестерина.

Источник

Биохимия крови у крысы

В медицинской биотехнологии постановка экспериментов при помощи моделирования патологических состояний, например ожогового повреждения кожи, имеет огромное значение для глубокого исследования крови и кроветворных органов [3]. Исходя из этого, необходимо тщательное и всестороннее изучение всех изменений, которые происходят в организме при этих воздействиях. Главным образом это относится к системам поддержания гомеостаза [2].

Ожоговые поражения кожи стали в современном мире одним из наиболее социально значимых и распространенных типов травматических повреждений у человека. Изучению вопроса реакции клеток крови на ожоги посвящен ряд исследований [1, 8].

Любое заболевание, патологический процесс, а также ряд физиологических сдвигов могут в той или иной степени отразиться на количественных и качественных особенностях состава циркулирующей крови [5]. Этим и определяется огромное значение необходимости изучения крови. Белые клетки крови, имея высокую реактивность, быстро включаются в адаптационные реакции. Они способны к неспецифическому реагированию в ответ на альтерирующие воздействия.

Термическая травма сопровождается развитием интоксикации. Кровь в первую очередь подвергается действию токсических веществ, возникших в очаге поражения [1].

Свой вклад в общее состояние системы организма вносят компоненты крови. Наиболее уязвимым объектом для действия продуктов свободнорадикального окисления липидов является стенка кровеносных сосудов, что обусловлено высоким уровнем кислорода в крови и низким уровнем его утилизации [9]. В условиях патологического процесса происходит поражение неклеточного компонента сосудистой стенки.

Цель исследования – изучение показателей периферической крови половозрелых крыс в норме и в условиях термического воздействия.

Материалы и методы. Объектом исследования явились 50 беспородных крыс-самцов 4-месячного возраста. Во время эксперимента регистрировали общее состояние и поведение животных. Самцы крыс были разделены на пять групп по типу воздействия:

I группа – животные, не подвергшиеся ожоговому воздействию (контрольная, 10 шт.);

II группа – животные, получившие ожоговое воздействие и не подвергшиеся терапии (10 шт.). Раны регенерировали естественным путем;

III группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии спреем «Д-Пантенол» (10 шт.);

IV группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии бальзамом мазевой формы «Спасатель» (10 шт.);

V группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии аппликациями настойки календулы (10 шт.).

Исследование морфологических и биохимических показателей периферической крови заключалось в определении количества лейкоцитов, количества эритроцитов, лейкоцитарной формулы, уровня гемоглобина, перекисной резистентности эритроцитов.

Уровень гемоглобина в образцах крови крыс определяли электрофотометрическим способом на гемоглобинометре APEL Hemoglobinmeter HG-202. Мазки фиксировали и окрашивали по Романовскому – Гимзе. Идентификация форменных элементов крови проводилась согласно методике Н. Т. Ивановой [4]. Количество эритроцитов крови подсчитывали по стандартной методике в камере Горяева. Количество лейкоцитов считали по мазкам крови крыс.

Для оценки уровня свободнорадикального окисления и выраженности в связи с этим липолитических процессов в крови проводили измерение перекисной резистентности эритроцитов. Перекисный гемолиз эритроцитов является чувствительным показателем, отражающим про– и антиоксидантный баланс организма [6].

Для определения перекисного гемолиза эритроцитов использовали модификацию методов определения степени перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) А. А. Покровского и А. А. Абразцова [7], которую предложили А. Е. Лазько, Р. И. Асфандияров и А. А. Резаев [4].

Результаты исследования и их обсуждение. Анализ гематологических исследований экспериментальных животных показал, что наиболее высокий уровень гемоглобина периферической крови наблюдался у крыс, лечившихся бальзамом «Спасатель» и спреем «Д-пантенол», что наглядно отображено в таблице 1. В группе крыс, лечившихся настойкой календулы, данный показатель незначительно отличался от значений у обожженных животных, не получавших лечения.

Гематологические показатели через 3 суток после ожоговой травмы

Источник