Хроническая токсичность у крыс
ИЗУЧЕНИЕ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ НАТРИЯ СУКЦИНАТА
, М.И. Борщевская, д.фарм.н., И.И. Волченскова, к.х.н., Л.М. Корчевая, к.б.н., Н.Н. Майданевич
Институт онкологии АМН Украины, Киев, Украина,
Открытое Акционерное Общество «Фармак», Киев, Украина
Натрия сукцинат (НС) относится к физиологически активным веществам, участвующим в метаболических процессах в качестве интермедиаторов цикла Кребса. Как показали эксперименты на моделях различных патологических процессов у животных 6, введенный НС повышает устойчивость организма и стимулирует его адаптационные реакции, положительно влияет на работу мозга, сердца, легких, печени, желез внутренней секреции и других жизненно важных органов. В результате клинических испытаний обнаружено, что НС полезен в качестве лечебного средства вспомогательной терапии при различных заболеваниях, особенно сопровождающихся метаболическим ацидозом, медикаментозной и химической интоксикацией или гипоксией разного генеза. Установлено, что НС улучшает результаты лечения больных, страдающих депрессивными состояниями, ишемией сердца, инфарктом миокарда, туберкулезом легких, хронической неспецифической пневмонией, астматическим бронхитом и бронхиальной астмой, хроническим вирусным гепатитом, гипоацидным гастритом 10.
Механизм активности экзогенного НС обусловлен тем, что он коррегирует нарушения энергетического обмена, вызванные в тканях разобщением окисления и фосфорилирования с утратой дыхательного контроля. После введения в организм препарат проникает в клетки и включается в цикл Кребса, способствуя быстрому образованию высокого уровня богатых энергией веществ [5].
В условиях изменения функциональной деятельности дыхательной цепи НС в большей степени, чем другие участники цикла Кребса, способствует повышению содержания восстановленных пиридин-нуклеотидов, инициирующих восстановительные процессы [14], нормализует нарушения в изоферментном спектре лактат — и малатдегидрогеназ [11], повышает активность сукцинатдегидрогеназы и стимулирует компенсаторные реакции клетки [4]. Под действием НС, кроме реактивации окислительного фосфорилирования, происходит непрерывное пополнение фонда цитоплазматических веществ, необходимых для микросомального окисления [5, 15, 16]. В стрессовых ситуациях НС восстанавливает систему нейрогуморальной регуляции, доводя до нормального уровня пониженное содержание катехоламинов и серотонина в крови [3].
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению разных видов терапевтической активности НС, в литературе отсутствуют сведения о токсичности препарата, соответствующие современным требованиям доклинического исследования физиологически активных веществ. Имеющиеся данные отрывочны и противоречивы. В одних публикациях указывается, что НС нетоксичен [1, 2], в других утверждается, что его терапевтические дозы (400-1000 мг/кг) в 30-60 раз ниже, чем токсические [5].
Отсутствие информации о характере и степени выраженности повреждающего действия НС на организм не дает возможности судить о его потенциальной опасности, а это препятствует разработке мероприятий по терапии интоксикаций, связанных с передозировкой или повышенной чувствительностью к препарату, и вызывает необходимость изучения его токсических свойств.
Цель настоящей работы — изучить острую и хроническую токсичность (НС) в эксперименте.
Материалы и методы исследования
Изучение острой и хронической токсичности НС проводилось в соответствии с рекомендациями Фармакологического Комитета [17]. В работе использовали два вида животных: нелинейных, здоровых половозрелых мышей и крыс обоего пола из питомника Института онкологии АМН Украины. Подготовку животных к исследованию проводили по общепринятой схеме (голодание, маркировка, взвешивание, разделение по группам). Условия содержания животных соответствовали общепринятым стандартам по экспериментальному изучению безопасности веществ [18].
Острую токсичность изучали на 144 мышах с массой тела 20±2 г и 80 крысах с массой тела 150-200 г. НС вводили однократно двумя путями: внутрибрюшинно и перорально. После введения разных доз препарата регистрировали сроки развития интоксикации и гибели животных, а затем устанавливали взаимосвязь между количеством выживших животных и дозой. Показатели острой токсичности определяли на основе анализа зависимости доли выживших животных от дозы. Анализ проводили методом нелинейной регрессии с использованием стандартного пакета программ STATISTICA [19].
Эксперименты по оценке хронической токсичности НС проводили на 60 мышах и 60 крысах обоего пола. Препарат вводили ежедневно на протяжении 3 мес тремя путями: перорально в дозе 600 мг/кг, внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг и внутримышечно в дозе 200 мг/кг. НС вводили также ежедневно внутрибрюшинно в дозе 800 мг/кг на протяжении 15 сут с последующим одноразовым введением 3200 мг/кг и в дозах сначала 2400 мг/кг на протяжении 13 сут, а затем 3000 мг/кг на протяжении 7 сут. В последнем случае животные получили за 20 сут 52200 мг/кг препарата.
В ходе экспериментов визуально оценивали общее состояние животных, особенности их поведения, реакции на болевые, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, внешний вид волосяного и кожного покрова, потребление корма и воды, изменения в физиологических отправлениях. С помощью стандартных методов контроля проводили общий анализ мочи и следили за показателями крови (морфологический состав, свертываемость), функции почек и печени; измеряли также массу тела животных, их органов. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента. Кроме того проводили макроскопические исследования внутренних органов.
Результаты и их обсуждение
При изучении острой токсичности НС установлено, что через 3-5 мин после одноразового внутрибрюшинного или перорального введения препарата поведение животных изменяется: они поодиночке расползаются по периметру клетки, не принимают корм и не пьют воду, теряют подвижность, не реагируют на болевые, световые и звуковые раздражения. Через 10—20 мин животные засыпают, их дыхание становится поверхностным и учащенным, а через 20—40 мин часть животных погибает (табл. 1).
Применение метода нелинейной регрессии для анализа данных (табл. 1) показывает, что независимо от вида животных, их пола, а также пути введения НС существует достоверная негативная корреляция между количеством выживших особей n (в долях) и дозой НС (d мг/кг). При этом зависимость n от d выражается уравнением экспоненты:
N = e b(D-Dо) ,
где b и D0 константы, зависящие в основном от пути введения препарата, D0 — максимальная доза, не вызывающая гибели животных, а b — угол наклона линейной зависимости ln N от D с коэффициентом корреляции — R>0,95. Значения констант уравнения и величины R, рассчитанные из результатов тестирования НС на мышах и крысах при одноразовом внутрибрюшинном или пероральном путях введения, представлены в табл. 2.
Показатели острой токсичности НС, характеризуемые дозами, вызывающими гибель 50 % (LD50) и 90 % (LD90) животных, найденные на основе экспериментальных данных с помощью уравнения и соответствующих параметров b и D0, представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 3, острая токсичность НС при внутрибрюшинном введении мышам характеризуется ld50=3923±141 мг/кг, при пероральном — ld50=7998±304 мг/кг. Для крыс показатель ld50 при внутрибрюшинном и пероральном введениях равен 3885±97 мг/кг и 8175±238 мг/кг, соответственно. Таким образом, препарат проявляет при внутрибрюшинном введении более высокую токсичность, чем при пероральном.
Результаты исследования острой токсичности НС на двух видах животных свидетельствуют, что в соответствии c общепринятой классификацией [20] этот препарат относится к умеренно токсичным веществам.
При вскрытии животных, погибших в опытах по изучению острой токсичности НС, макроскопически отмечено полнокровие внутренних органов и изменение внешнего вида головного мозга, сердца, легких и печени. Мозг наполнен жидкой алой кровью, в нем наряду с переполненными кровеносными сосудами встречаются точечные кровоизлияния. При этом масса мозга уменьшилась на 18-23 %. Сердце и легкие спались, в них, а также в печени, почках, грудной и брюшной полостях обнаружены сгустки крови. Масса сердца уменьшилась на 7-12 %, а легких — на 7-8 %. Масса печени и почек практически не изменилась, но печень приобрела темно синий с сиреневым оттенком цвет.
Выжившие при изучении острой токсичности животные через 40-60 мин после введения НС просыпаются, но остаются малоподвижными. Они собираются у поилки и непрерывно на протяжении 3-4 ч пьют воду, что сопровождается учащенным мочеиспусканием. Спустя 1 сут подвижность животных восстанавливается, потребление корма и физиологические отправления нормализуются. В первые несколько суток после введения препарата животные худеют, но затем масса их тела постепенно увеличивается, а через 14 сут восстанавливается до нормального уровня. Наибольшая потеря массы тела (на 20 %) наблюдается через 3 сут после введения НС. Внешний вид волосяного покрова и кожи на протяжении эксперимента остается без изменений.
У выживших при внутрибрюшинном введении НС животных (у мышей через 2 сут после инъекции 3802 мг/кг и у крыс через 2 ч после инъекции 3450 мг/кг) показатели морфологического состава крови и ее биохимические параметры не выходят за пределы колебаний физиологической нормы (табл. 4). Однако очень резко изменяются показатели свертываемости крови: у крыс больше, чем на порядок, увеличивается протромбиновое время и соответственно уменьшается протромбиновый индекс.
При исследовании хронической токсичности НС установлено, что ежедневное введение препарата на протяжении 3-х мес мышам в дозе 600 мг/кг перорально, а крысам в дозе 400 мг/кг внутрибрюшинно и в дозе 200 мг/кг внутримышечно не вызывает каких-либо изменений в общем состоянии и поведении животных: они остаются активными, еду поедают полностью, пьют по мере необходимости, нормально реагируют на прикосновения, болевые и световые раздражения. При наблюдении за животными не отмечено изменений в размерах зрачка, нарушений тонуса мышц и положения хвоста, координации движений, появления лакримации и саливации. Внутрибрюшинное, внутримышечное и пероральное введение НС животным на протяжении 3 мес не влияет на частоту и глубину их дыхания, физиологические отправления, не изменяет количество, прозрачность, цвет и реакцию суточной мочи; в моче не выявлено сахара, креатинина; микроскопия осадка остается в пределах контрольных величин. Препарат не изменяет морфологический состав крови, скорость ее свертывания и биохимические показатели, характеризующие функции почек и печени. Не выявлено также достоверных отличий массы тела животных, которые получали НС при любом из исследованных путей введения, по сравнению с контролем. Аналогичная картина наблюдается при исследовании хронической токсичности НС, вводимого мышам внутрибрюшинно в дозе 800 мг/кг ежедневно на протяжении 15 сут. Однако, несмотря на нормальный уровень контролируемых показателей, у животных повышается чувствительность к токсическому действию одноразовой дозы препарата. Так, если после того, как мыши получили суммарную дозу 12000 мг/кг, им ввести однократно 3200 мг/кг препарата, то 50 % животных погибает. Все интактные особи, получившие такую одноразовую дозу, остаются живы. Поведение погибших и выживших животных, состояние их внутренних органов, реакции на внешние раздражения, а также морфологический состав и биохимические показатели крови соответствуют таковым, которые наблюдаются при изучении острой токсичности.
Ежедневное внутрибрюшинное введение НС мышам в дозе 2400 мг/кг на протяжении 13 сут, а затем в дозе 3000 мг/кг на протяжении еще 7 сут (в сумме 52200 мг/кг) не вызывает гибели животных, но через 20 мин после каждой инъекции животные теряют подвижность, не реагируют на звук, свет и болевые раздражители, в течение 2 ч усиленно пьют воду, корм потребляют умеренно. Масса тела животных медленно, но постепенно уменьшается и к концу эксперимента разница по сравнению с массой тела контрольных животных составляет 20-25 %.
Таким образом, принятые до настоящего времени представления о низкой токсичности НС не отвечают действительности и на самом деле отражают лишь тот факт, что в тех дозах, в которых изучались лечебные свойства препарата, его токсичность не проявлялась. Найденные нами параметры острой токсичности НС при внутрибрюшинном и пероральном путях введения мышам и крысам свидетельствуют, что он относится к умеренно токсичным веществам. Следует отметить, что морфологический состав и биохимические показатели крови не отражают реакцию организма на токсическое действие препарата и не позволяют выявить причину гибели животных. Возможно, она обусловлена обнаруженными нами существенными нарушениями в свертывающей системе крови. НС, вводимый ежедневно в течение 3 мес внутримышечно в дозе 200 мг/кг, внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг и перорально в дозе 600 мг/кг, не проявляет токсического действия на органы и системы мышей и крыс, не влияет на массу тела лабораторных животных. Однако надо иметь в виду, что безопасные дозы могут стать опасными на фоне предшествующего длительного ежедневного введения препарата.
Литература
1. Беренштейн Э.Л. Морфология сердца при длительной гипокинезии и коррекции изменений сукцинатом натрия / Автореф. дис. … канд. наук —Москва, 1990. —20 с.
2. Оникиенко В.Н. Морфогенез костной ткани при коррекции иммобилизационного стресса сукцинатом натрия / Автореф. дис. … канд. наук —Киев, 1989. —18 с.
3. Голова И.Д. Влияние сукцината натрия и хлорида лития на механизмы эмоционального стресса / Актуальные пробл современной физиологии. —Киев: Наукова думка, 1986. —С. 45-46.
4. Кочетыгов Н.И., Панышева Т.Ю., Ремизова М.И. Влияние сукцината натрия на восстановление функциональной деятельности митохондрий при ожоговом шоке в эксперименте // Пат. физиология и эксперимент терапия. —1984. —№1. —С. 33-35.
5. Малюк В.И., Молотков В.Н., Коржов В.И. Метаболические нарушения при острых интоксикациях и их коррекция сукцинатом натрия // Врачебное дело. —1981. —№8 (869). —С. 66-68.
6. Морозова К.И. К вопросу о противокварцевом эффекте сукцината // Профессиональные болезни пылевой этиологии. —1988. —Том 11. —С. 93-100.
7. Сокирко Т.А., Туманова Т.А. Коррекция сукцинатом натрия нарушений энергетического обмена в митохондриях печени и легких при лечении туберкулостатическими препаратами экспериментального туберкулеза / Туберкулез —Киев: Здоров’я, 1985. Вып. 17. —С. 91-93.
8. Запоточный Б.А. Влияние инсулина и сукцината натрия на высшую нервную деятельность у депрессивных больных // Актуальные пробл современной физиологии. Киев: Наукова думка, 1986. —С. 59-60.
9. Применение сукцината натрия у больных, перенесших инфаркт миокарда / Актаева И.Н., Гулый В.Я., Лихтенштейн И.Е., Мамак В.И., Бугаенко В.В. // Врачебное дело. —1985. —№6. —С. 6-8.
10. Деркач В.С. Эффективность сукцината натрия при химиотерапии впервые выявленных больных деструктивным туберкулезом легких / Туберкулез. —Киев, 1983. —127 с.
11. Характер Ж.З., Мажак К.Д. Применение сукцината натрия в предоперационной подготовке больных туберкулезом и раком легких / Актуальные вопросы хирургии легких на современном этапе. —Киев, 1990. —С. 155-156.
12. Деркач В.С. Профилактика и устранение осложнений туберкулостатической терапии с помощью сукцината натрия / Актуальные вопросы физиопульмонологии. Тезисы докл. республик научн конфер 29-31 марта 1983 г —Киев, 1983. —С. 24-25.
13. Эффективность применения сукцината натрия в комплексном лечении астматического бронхита и бронхиальной астмы у детей и подростков / Рущак В.А., Николаева О.Д., Кугук Л.И., Острищенко А.А. // Пульмонология, —Киев: Здоров’я, 1987. —Вып. 8. —С. 91-94.
14. Ніженковська І.В., Чекман І.С., Олійник С.А. Вплив суфану на енергетичний обмін міокарда в умовах серцевої недостатності, зумовленої дією рубоміцину // Укр. химиотерапевт. журн. —2000. —№1(5). —С. 55-59.
15. Коржов В.И. Влияние рифампицина и сукцината натрия на НАДФ.Н-зависимое окисление в печени / Фармакол и токсикол, Киев: Здоров’я, 1981. Вып.16. —С. 86-88.
16. Коржов В.И. Влияние этионамида и сукцината натрия на НАДРН-зависимое окисление в печени // Укр. биохим. журн.. —1980. —Т. 52, №5. —С. 593-596.
17. Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Либерман С.С. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических cредств // Ведомости фармакологического комитета. —1998. —№ 1. —С. 27-32.
18. Стефанов О.В. Коваленко О.І. Міжнародні стандарти експериментального вивчення безпечності речовин // Современ. пробл. токсикол. —1998. —№ 1. —С. 12-14.
19. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. —М.: Информационно-издательский дом Филинъ, 1997. —608 с.
20. Губский Ю.И., Долго-Сабуров В.Б., Храпак В.В. Химические катастрофы и экология. —Киев: Здоров’я, 1993. —224 с.
Источник