Каррагениновый отек лапы у крыс

Впервые в 1958 г. Арон Лернер из Йельского университета (США) выделил из эпифиза быка, изучил и описал структуру мелатонина (N-ацетил-5-метокситриптамин) (рис.1). Эта биологически важная молекула впоследствии была найдена в сетчатке глаза, клетках костного мозга, кишечника и кожи. Изначально мелатонин считался гормоном, участвующим в синхронизации механизмов циркадного ритма в организме.

Рис.1 Структурная формула мелатонина

Позже было установлено, что кроме этой гормональной функции он принимает участие в регуляции сезонного и лунного циклов у животных и человека. Кроме того, он является тканевым фактором и одним из самых мощных и доступных эндогенных антиоксидантов и регуляторов иммунной системы. Если учесть, что мелатонин синтезируется также лимфоцитами, а рецепторы мелатонина найдены в мембранах тимоцитов, это дополнительно свидетельствует о значительном влиянии на функцию иммунной системы [5].

В организме человека мелатонин принимает участие в формировании многих патологических событий, включая канцерогенез и старение, когда отмечается снижение уровня данного гормона. Кроме того, уровень мелатонина в крови снижен у хронических курильщиков и у людей с повышенным индексом массы тела.

· снижается температура тела;

· уменьшается уровень стрессовых гормонов и эмоциональное напряжение;

· возникает сонливость, наступает сон;

· падает давление крови, замедляется ритм сердечных сокращений;

· тормозится работа органов пищеварения и половой системы;

· восстанавливаются обменные процессы в головном мозге, происходит обработка информации, полученной за день.

Концентрация гормона достигает максимума к полуночи, держится на высоком уровне до 5 часов утра. Максимальные показатели гормона в детском возрасте, затем в период полового созревания они снижаются и вновь возрастают у молодых людей 20-23 лет. После 50 лет начинается прогрессивное уменьшение синтеза гормона и к 65 годам его в крови содержится на 20% меньше, чем у 45-летних [1].

Локальная мелатонинергическая система обнаружена в коже животных и человека. Мелатонин кожи участвует в процессах роста и пигментации волос, защищает клетки от воздействия ультрафиолета и других экзогенных и эндогенных повреждающих факторов.

Созданный в качестве фармакологического препарата мелатонин обнаружил необычайно широкий диапазон лечебных возможностей, которые оказались востребованы при различных патологических состояниях головного мозга и внутренних органов. Многие из них (церебральный отек, поражения желудочно-кишечного тракта, болевой синдром и др.) неизменно сопровождает воспаление, ограничение которого могло бы служить одной из целей терапевтического воздействия мелатонина. Это обстоятельство побудило обобщить факты, свидетельствующие и наличии у мелатонина противовоспалительных свойств, а также изучить данные свойства в ходе эксперимента [3].

Противовоспалительные возможности мелатонина

Способность мелатонина ограничивать воспалительный процесс определяется, по-видимому, совокупностью механизмов, имеющих как регионарное, так и системное происхождение. К числу местных факторов можно отнести прямое влияние мелатонина на отдельные компоненты воспалительной реакции, изменение иммунной реактивности и ограничение оксидантного стресса.

Одним из важнейших элементов антиэкссудативного действия мелатонина следует признать его вмешательство в каскад арахидоновой кислоты с нарушением синтеза простагландинов. Этот факт был установлен в опытах in vitro еще в начале 80-х годов прошлого века. Уже тогда обращалось внимание, с одной стороны, на сходство ингибиторных эффектов мелатонина и индометацина, а с другой – на вероятность их реализации в мозговой ткани (медиобазальном гипоталамусе) крыс [3,4].

Позднее на модели провоцируемой липосахаридом гипертермии и активации макрофагов было показано, что противовоспалительная активность мелатонина не зависит от непосредственного влияния на простогландиновые рецепторы, но определяется угнетением функции фермента циклооксигеназы (ЦОГ), индуцибельная изоформа которой – ЦОГ-2, являясь ключевым этапом в биосинтезе простогландинов, играет, как известно, критическую роль в воспалительном ответе при разных формах патологии.

Синтез индольного соединения мелатонина в секреторных клетках шишковидной железы — пинеалоцитах — происходит в несколько этапов. Исходным звеном является триптофан, который через серотонин и N-ацетилсеротонин превращается в конечный гормон. Ключевыми ферментами синтеза являются N-ацетилтрансфераза и гидроксииндол-O-метилтрансфераза. Образующийся мелатонин секретируется главным образом в спинномозговой жидкости, из которой он попадает в сосудистое русло, а затем переносится по всему организму кровотоком. В структурах головного мозга и периферических органах действие гормона осуществляется через специфические рецепторы (в основном, типов MT1 и MT2) [5].

Показательно, что образование эпифизарного мелатонина, вне в зависимости от видовых особенностей животных, максимально выражено в темноте и минимально на свету. Это обстоятельство дает основание рассматривать шишковидную железу как важную хронотропную железу, которая благодаря тесным морфофункциональным связям с драйвером циркадного ритма — супрахтмическими ядрами гипоталамуса — циркадными колебаниями различных физиологических функций. Учитывая факт преобладающей секреции мелатонина в темноте, они стали приписывать непосредственный интерес формированию цикла сна-бодрствования. В результате мелатонин приобрел репутацию естественного организатора биологических ритмов — хронобиотика и природного гипногенного агента.

В 70-е годы минувшего века иммуногистохимическая техника позволила установить наличие наряду с эпифизарным собственного мелатонина в различных периферических тканях. Содержащие его, в большинстве своем энтерохромаффинные, клетки принадлежат к ряду апудоцитов и наиболее полно представлены в различных элементах желудочно-кишечного тракта [4].

Как и в эпифизе, внеэпифизарный мелатонин проходит аналогичные этапы синтеза при участии тех же ферментов. Знаменательно, что его общее количество в ткани этих органов в десятки раз превосходит уровень плазменного мелатонина эпифизарного происхождения. После удаления эпифиза исчезают суточные колебания содержания гормона в плазме крови, но за счет периферических клеточных элементов в дневные часы он продолжает в определенном количестве удерживаться в сосудистом русле.

Влияние мелатонина на воспалительный процесс

Существует ряд клинических и экспериментальных данных о влиянии мелатонина на различные патологические состояния, связанные с воспалением. Среди них воспалительные поражения суставов, внутренних органов (например, язвенный колит), периферических нервов. Следует сразу подчеркнуть, что такие факты не всегда однозначно указывают на клиническую эффективность препарата [3,5].

Прежде всего, по наблюдениям отдельных исследователей, повторное введение препаратов мелатонина пациентам с ревматоидным артритом может успешно дополнить базовую терапию и повысить ее эффективность. Так, при ежедневном применении (3 мг в сутки) описано более выраженное ослабление утренней скованности, уменьшение количества опухших и болезненных суставов. Клиническое улучшение коррелировало с нормализацией ночного сна и перестройкой ритма суточной секреции кортизола. При более высокой дозе (10 мг) мелатонин наряду с некоторым ограничением симптомов ревматоидного артрита значительно оптимизировал антиоксидантный статус у пациентов. Многочисленная информация также представлена ??о способности мелатонина (3-6 мг) снимать головные боли различного происхождения. У людей и животных мелатонин также ограничивал ототоксическое действие аминогликозидных антибиотиков, оптимизировал лечение пациентов с ожогами, а при длительном (6-12 месяцев) применении улучшал состояние пациентов с язвенным колитом. В то же время имеются данные о способности мелатонина в некоторых случаях обострять течение ревматоидного артрита у пациентов и при его экспериментальном моделировании на животных [5].

Учитывая преобладание информации, указывающей на ограничение воспалительных проявлений мелатонина, вводимого извне, следует признать, что важно искать связь между уровнем эндогенного мелатонина и выраженностью симптомов. Однако результаты этого поиска еще не дают однозначных выводов. Согласно одной информации, радиоиммунное определение уровня гормонов плазмы у пациентов с ревматоидным артритом в ночное время указывает на снижение его значения по сравнению со здоровыми людьми, и, согласно другим данным, ревматоидный артрит и анкилозирующий спондилит, напротив, сопровождаются, напротив, увеличение секреторной активности шишковидной железы. Однако есть указание на то, что при патологии, в отличие от нормы, кривая суточной выработки мелатонина выглядит иначе, поскольку пик его содержания в плазме смещается вперед на несколько часов. Однако защитный, адаптивный характер эпифизарной гиперактивности в ответ на первичное воспалительное поражение не исключен.

Определение противовоспалительной активности мелатонина на модели «каррагенинового» отека лапы у крыс.

Материалы и методы

Изучение противовоспалительной активности мелатонина проводили на модели «каррагениновый отёк лапы» у крыс. Эксперименты выполнены на 30 белых неинбредных крысах средней массой 325,97±1,2 г. Подопытных животных содержали в условиях вивария (с естественным режимом освещения; при температуре 22–24; относительной влажности воздуха 40–50 %) с использованием стандартной диеты (ГОСТ Р 50258-92). Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики (GLP) при проведении доклинических исследований в РФ, а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986).

Противовоспалительную активность мелатонина оценивали в экспериментах на модели «каррагенинового» отека лапы. Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили субплантарным (под подошвенный или плантарный апоневроз) введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина (сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха) [2]. Выраженность воспалительной реакции оценивали через 3, 12 часов после индукции воспаления по изменению объема лапы (онкометрически). Исследуемые вещества наносили на лапы крыс в виде мази. Противовоспалительный эффект, оцениваемый по уменьшению отека, выражали в процентах по отношению к контролю.

В качестве исследуемого вещества был выбран мелатонин в составе двух препаратов: Мелатонин + L-теанин 200 мг (Производитель: Nature Made) и Мелаксен (Производитель: Юнифарм) . Исследуемые вещества наносили на лапы крыс в виде мази, изготовляемой непосредственно перед экспериментом путем добавления измельченных препаратов к мазевой основе (10% раствор Натрий –КМЦ). Препаратом сравнения был выбран Диклофенак– стандартное НПВС.

Подопытные животные были разделены на 4 группы (по 6 крыс в каждой):

1) Крысы, получавшие Мелатонин с теанином в дозе 10 мг/мл – 0,1 мл;

2) Крысы, получавшие Мелаксен в дозе 10 мг/мл – 0,1 мл;

3) Крысы, получавшие Диклофенак в дозе 10 мг/мл – 0,1 мл;

4) Крысы контрольной группы

Было выявлено, что при субплантарном введении 0,1 мл 1 % раствора каррагенина у подопытных крыс развивается выраженный отек лапы, о чем свидетельствует достоверное увеличение ее объема. Отмечено, что максимальный отёк лапки (пик воспаления) развивался через 3 часа после введения каррагенина, при этом объем лапы у подопытных животных контрольной группы увеличивался в среднем на 82,5 %±5,7%.

При нанесении НПВС Диклофенака показатель прироста объема лапы составил 28,33±5,4% через 3 часа после индукции воспаления и нанесения препарата по сравнению с фоновым значением. При нанесении препаратов мелатонина это значение составило в среднем 52,08±7,7%. Также были найдены достоверные отличия между мелатонинсодержащими препаратами: прирост объема лапы крысы при применении Мелатонина с L-теанином составил 63,33±5,4%, Мелаксена – 40,83±9,9%.

При онкометрическом измерении объема лап крыс через 12 часов после индукции воспаления и нанесения препаратов достоверно наблюдалось уменьшение объема лап крыс по сравнению с измерениями через 3 часа после индукции воспаления: при нанесении Диклофенака на 15,33±2,4%; мелатонинсодержащих препаратов — на 23,33±5,6% в среднем. Причем показатели мелатонинсодержащих препаратов достоверно отличались между собой, при нанесении Мелатонина с L-теанином объем лап крыс уменьшился на 26,63±5,8%, при нанесении Мелаксена – на 20,03±5,3%.

Показатели объема лапы крыс в мл. (Таблица №1):

Источник

Доклинические исследования

Изучение безопасности лекарственных средств и химических веществ

Острая токсичность
- Острая кожная токсичность
- Острое кожное раздражение
- Острое глазное раздражение
- Острая токсичность при внутрижелудочном введении, метод фиксированных доз
- In Vitro раздражение кожи: метод оценки реконструкции эпидермиса человека (оценка цитотоксичности — МТТ-тест)
Подострая (субхроническая) токсичность
- Субхроническая токсичность при накожном нанесении: 90 дневное исследование
- Отсроченная нейротоксичность фосфорорганических веществ после острой токсичности
Хроническая токсичность
- Хроническая 28 дневная токсичность при внутрижелудочном введении грызунам
- Хроническая 90 дневная токсичность при внутрижелудочном введении грызунам
- Хроническая токсичность при накожном нанесении в течении 21/28 дней
- Отсроченная нейротоксичность при 28 дневном введении фосфорорганических соединений:
- Исследование хронической токсичности
Аллергизующие свойства
- Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок) на морских свинках;
- Активная кожная анафилаксия на морских свинках;
- Конъюнктивальная проба на морских свинках;
- Метод кожных аппликаций;
- Оценка уровня IgE методом иммуноферментного анализа (дополнительно).
- Сенситизация кожи

Изучение лекарственных средств и химических веществ, влияющих на ЦНС и физическую работоспособность

Тест вынужденного плавания (Porsolt Test)
Методика условного защитного закапывания
Методика оценки поведения в темной/светлой камере
Тест подвешивания за хвост у грызунов
Острый болевой синдром. Оценка анальгезирующего действия ФВ на моделях:
Ноцицептивные болевые модели:
Горячая пластина (hot plate)
Холодная пластина, (cold plate)
Прижигание хвоста, (tail-flick)
Стептозотоцин-вызванная диабетическая нейропатия
Модель болевого синдрома при алкогольной нейропатии
Каррагениновая,
Дегенеративные заболевания мозга (болезнь Паркинсона)
Методика условного предпочтения места (Conditioned place preference)
Оценка депривационного эффекта (алкоголя, сахарина и других ФВ)

Модели изучения противовоспалительного действия

Каррагениновый отек лапы крысы; Мышь с больной лапой
Каррагениновый подкожный пузырек у крысы;
Формалиновый отек лапы крысы;
Ватная гранулема;
Воспаление слизистой желудка на моделях химического и механического раздражения;
Контактный дерматит;

Перечисленные модели могут сопровождаться биохимическими, гематологическими, гистологическими и рентгенологическими исследованиями.

Модели изучения гастро- и энтеропротекторных лекарственных средств

Изучение гастропротекторных ФВ:
- Изучение противоязвенного действия ФВ на модели перевязки пилорического отдела желудка по методу Shay
- Определение противоязвенной активности ФВ на модели индометациновой язвы у крыс
- Оценка цитостатического действия ФВ в отношении Helicobacter pylori

Изучение спазмолитического эффекта ФВ:

Оценка спазмолитического эффекта ФВ на модели ex vivo (оценка тонуса терминального сегмента подвздошной кишки.)
Изучение влияния ФВ на нормализацию состава желчи на модели литогенной диеты

Биохимические тесты:

Оценка активности ферментов;
Оценка состава желчи.

Модели изучения лекарственных средств, влияющих на метаболические нарушения

Оценка активности на модели экспериментального диабета 2-го типа, индуцированного однократным введением стрептозотоцина
Оценка активности на модели экспериментального диабета 1-го типа, индуцированного введением аллоксана
Изучение гиполипидемического действия
Изучение антиатеросклеротического действия на кроликах
Изучение антиоксидантных свойств на модели предельной физической нагрузки
Изучение механизмов антиатерогенного действия:
Определение влияния ФВ на энзиматическую активность 3-гидрокси-3-метил-глютарил коэнзим А редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы)
Оценка активности на модели метаболического синдрома у крыс
Изучение механизмов антиатерогенного и гипогликемического действия

Биохимические тесты:

глюкоза
глюкозо-толерантный тест
лактат
гликозилированный гемоглобин
инсулин
глюкагон
адипонектин
лептин
триглицериды
общий холестерин
α — холестерин
протромбиновое время
активированное частичное тромбопластиновое время
фибриноген
малоновый диальдегид
глутатион восстановленный
оксид азота

Гематологические тесты:

форменные элементы крови
гематокрит
ретикулоциты

Физиологические исследования:

неврологический статус
болевая и тактильная чувствительность
двигательная активность
эмоциональный статус
когнитивные функции
выносливость в тесте «Вынужденное плавание»

Патоморфологические исследования

Изучение гепатопротекторов и лекарственных средств желчегонного действия

CCl4, этанол-индуцированный гепатит;
Изучение влияния ФВ на нормализацию состава желчи на модели литогенной диеты;

Биохимические тесты в периферической крови и ткани печени:

АЛТ,Мышь алкоголик
АСТ,
Общий и прямой билирубин,
Общий белок,
Альбумины,
Мочевина,
Общий холестерин,
α- холестерин,
триглицериды,
Глутатион восстановленный,
Глутатин-пероксидаза,
Глутатион-S-трансфераза,
Глутатионредуктаза,
Перекисное окисление липидов,
Расчет атерогенного индекса.

Анализ желчи (качественный и количественный состав желчи):

Скорость экскреции желчи,image100
рН,
холестерин,
холевая кислота,
дезоксихолевая кислота,
хенодезоксихолевая кислота,
урсодезоксихолевая кислота,
холато-холестериновый индекс.

Морфологическое исследование ткани печени

Изучение лекарственных средств, применяемых при кожных заболеваниях

Изучение раздражающих свойств накожных ФВ
Изучение сенсибилизирующих свойств накожных ФВ
Изучение противовоспалительных свойств
Изучение эффективности на модели контактного дерматита
Модель, вызванная 2,4-динитрохлорбензолом (DNCB)
Оценка ранозаживляющего действия ФВ на модели линейной кожной раны

Изучение противовоспалительных фармакологических веществ

Оценка противовоспалительной активности на модели воспаления: Каррагенин-индуцированный отек лапы крысы

Изучение лекарственных средств, применяемых в терапии органов чувств

Исследование местнораздражающего действия на роговицу и конъюнктиву глаза кролика
Оценка активности на модели повреждения сетчатки у кроликов
Изучение активности на модели травмы роговицы у кроликов

Для комплексной оценки эффективности применения ФВ проводят следующие диагностические процедуры:

клинический осмотр глаз с оценкой выраженности слезотечения, конъюнктивальной инъекции, отека конъюнктивы;
осмотр переднего отдела глаза с помощью щелевой лампы при травме роговицы для оценки расхождения краев раны, инфильтрации, эпителизации, выпота фибрина и образования компактного рубца роговицы;
осмотр глазного дна с помощью офтальмоскопа с целью оценки зоны острого повреждения сетчатки;
гистологическая оценка поврежденных структур глаза.

Источник