Клетки печени крысы под микроскопом

Клетки печени крысы под микроскопом

Зависимость большинства процессов жизнедеятельности организма от температуры окружающей среды делает температурные воздействия важнейшим фактором экологии, который может иметь решающее значение для выживания человека. С воздействием низких и сверхнизких температур человеку часто приходится встречаться при работе на различных производствах, а также в силу проживания – в некоторых климатических зонах. При этом пребывание организма в условиях гипотермического воздействия может приводить к значительным метаболическим и функциональным изменениям.

В условиях гипотермии печень как орган, вносящий значительный вклад в термопродукцию, играет очень важную роль [1–3]. За счет сложных биохимических реакций этот орган способен обеспечивать приспособляемость организма к сложным условиям существования. Печень обеспечивает пластические и энергетические процессы, а также регулирует адаптивные компенсаторно-приспособительные процессы, происходящие при воздействии всех экзогенных и эндогенных неблагоприятных процессов, и эта регуляция осуществляется даже тогда, когда повреждающие факторы не обладают выраженным гепатотропным эффектом [4]. Поэтому морфофункциональное состояние печени является отражением не только функционального состояния самого органа, но и реакции организма в целом.

Морфологические изменения органов человека и животных при воздействии неблагоприятных экзогенных факторов широко изучаются в последние годы [5–7]. Однако гистоструктура печени при воздействии гипотермии исследована лишь в ряде работ [8, 9], полученные данные противоречивы. Это касается, в частности, особенностей реакций гепатоцитов на холодовой фактор, характеристики числа двуядерных гепатоцитов и реакции ядер клеток печени в целом [10, 11].

Таким образом, сведения о влиянии гипотермии на гистоструктуру печени немногочисленны, а вопросы морфологии клеточного ядра гепатоцитов освещены недостаточно, поэтому необходимо проведение более детального изучения динамики морфологических изменений, происходящих в ядрах гепатоцитов при действии холодового фактора.

Цель исследования: проанализировать динамику патоморфологических изменений состояния ядер клеток печени крыс породы Вистар после воздействия однократной глубокой иммерсионной гипотермии.

Материалы и методы исследования

Исследование было проведено на 15 самцах крыс линии Вистар массой 200–250 граммов. Животных (n = 10) подвергали однократной глубокой водной (иммерсионной) гипотермии, которую моделировали помещением экспериментальных животных в индивидуальных клетках в воду температурой 5°С при температуре окружающей среды 7°С. Когда животные достигали глубокой степени гипотермии, воздействие холодового фактора прекращали. Критерием достижения глубокой степени гипотермии являлась ректальная температура 20–25°С. Время воздействия холодового фактора в среднем составляло 40±5 мин. Непосредственно сразу после прекращения охлаждения животные выводились из эксперимента декапитацией. Контрольную группу составляли 5 крыс, которых в индивидуальных клетках помещали в воду температурой 30°С при температуре окружающей среды 22–25°С.

Для гистологического исследования кусочки ткани печени фиксировали в течение 24 часов в 10%-ном растворе нейтрального формалина, после проводили обработку препаратов в автомате TISSUE-TEK VIPTM6 (Sakkura, Nagano Japan) с последующей заливкой в парафин в станции парафиновой заливки TISSUE-TEK TEC 5 (Sakkura, Nagano, Japan). На роторном микротоме Accu-Cut SRM (Sakkura, Китай) изготавливали срезы толщиной 5–7 мкм. В автостейнере TISSUE-TEK Prisma (Sakkura, Nagano, Japan) препараты окрашивали гематоксилин-эозином.

Для определения плоидности ядер гепатоцитов препараты окрашивали методом Фельгена с использованием холодного гидролиза в 1н. HCl в течение 1 часа 30 минут. Среднее содержание ДНК в ядре малого лимфоцита принимали за диплоидное значение (2с). Плодометрические измерения осуществляли в сертифицированной морфометрической программе ВидиоТест-Морфология 5.2. («ВидиоТест», Санкт-Петербург) с помощью специализированных модулей «Стандарт» и «Плоидность». Строили гистограммы распределения гепатоцитов по индексу накопления ДНК (ИНДНК) в ядре.

Для выявления гетерохроматина гистологические срезы окрашивали в 2%-ном растворе орсеина на 45%-ном растворе уксусной кислоты в течение 30 минут. Затем препараты фотографировали при помощи микроскопа Leica DM 750 E200 (Германия) с цифровой видеокамерой Leica EC3 (Германия) при увеличении х1000. Определяли среднее количество гранул гетерохроматина на 1 ядро, их локализацию и высчитывали содержание доли гетерохроматина от общей площади ядра клетки. Исследовали не менее 25–30 ядер клеток.

Окрашивание ядрышковых организаторов (AgNOR) проводили по двухступенчатому методу Daskal Y. et al. в нашей модификации [12]. Под масляной иммерсией микроскопа при увеличении х1000 высчитывали число ядрышек, площадь одного ядрышкового организатора и ядерно-ядрышковое соотношение в относительных единицах (отн. ед.).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 10.0. и пакета статистического анализа программы MS EXСEL 2010. Для каждой из полученных величин высчитывали среднее (M) и ошибку среднего (m). Гипотеза о нормальности распределения вероятности данных проверялась с помощью критерия Шапиро–Уилка. Достоверность данных оценивалась с помощью параметрического критерия t-теста Стьюдента. Критическое значение уровня статистической значимости было равно 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Контрольная группа. Морфологический анализ структуры ядер клеток печени животных контрольной группы позволил выявить следующее. Большинство гепатоцитов было одноядерными (79±1,5%), процент содержания двуядерных клеток составил 21±1,5%. При плоидометрическом исследовании ядер ИНДНК в среднем составил 3,9с±0,2. Ядра были представлены шестью уровнями плоидности: клонов клеток с ИНДНК 2с было 3,2%, 3с – 30%; 4c – 50%; 5c – 6,7%; 6c – 6,7% и 8с – 3,4% (табл.) (рис. 1).

Рис. 1. Гистограмма, характеризующая ИНДНК в группе контроля и при гипотермии.

По оси абсцисс – ИНДНК; по оси ординат – процентное содержание клеток

Морфометрические и морфофункциональные параметры ядер гепатоцитов при гипотермии в сравнении с группой контроля (М±m)

Источник

Клетки печени крысы под микроскопом

Повышенная продукция глюкозы печенью в результате угнетения гликолиза и усиления глюконеогенеза является характерной чертой сахарного диабета (СД) 2 типа. Данные процессы – ответственные за гипергликемию у больных СД 2 типа натощак. В то же время рост концентрации глюкозы в крови после приема пищи (постпрандиальной гликемии) связан с торможением утилизации глюкозы периферическими тканями, в первую очередь мышцами [1]. Это обусловлено нарушением синтеза гликогена в результате снижения активности гликогенсинтетазы и ослабления процессов окисления глюкозы вследствие дефекта в пируватдегидрогеназном комплексе. Свой вклад в данный процесс вносят изменения в секреторной функции панкреатических бета-клеток, что проявляется в торможении первой фазы инсулинового ответа и развитии гипергликемии [5; 8].С целью изучения сравнительной характеристики ультраструктуры печени в норме и при сахарном диабете в эксперименте проведено настоящее исследование.

Материал и методы исследования

Материалом исследования явились половозрелые крысы-самцы линии «Вистар» массой 100-130 г в количестве 90 штук. Перед забором материала подопытных животных усыпляли с помощью внутрибрюшинного наркоза с использованием тиопентала натрия. Забирали небольшую часть ткани печени крыс, которую помещали сразу в большую каплю 2%-ного раствора четырехокиси осмия на 0,1 М фосфатном буфере с сахарозой. Далее вырезали полоски ткани печени размером 0,8 х 0,1 х 0,1 см и переносили их в другую каплю фиксирующего раствора, размещенного на кусочке зубоврачебного воска ледяной плиты. Из полосок вырезали блоки ткани печени кубической формы размером 1 мм3, которые фиксировали 2%-ным раствором четырехокиси осмия на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,36) с добавлением сахарозы в течение двух часов на ледяной бане, после чего их отмывали буферным раствором [1]. Водонерастворимые смолами и отмытые от остатков фиксаторов тканевые блоки проводили через спирты восходящей концентрации и абсолютный ацетон. Затем материал помещали в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит путем проведения через растворы возрастающей концентрации, после чего их помещали в эпон-аралдит, находившийся в глицериновых капсулах [2; 3]. Полимеризацию материала проводили поэтапно при разных температурах от 36 до 60 °С в течение 24 часов. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме УМТП — 3М с помощью стеклянных ножей, изготовленных на приборе ССН — 1. Для исследования отбирали срезы серебристого или нежно-лимонного цвета. Срезы контрастировали сначала в 2℅-ном растворе уранилацетата [7], а затем – цитрата свинца [6]. Изучение и фотографирование материала проводили с помощью микроскопа УЕМВ — 100К .

В норме у интактных крыс печеночные пластинки построены из гепатоцитов, объединенных с помощью плотных контактов, образующих желчные канальцы. При ультраструктурном исследовании в цитоплазме гепатоцитов хорошо выражены канальцы эндоплазматической сети, многочисленные лизосомы и пероксисомы, цистерны комплекса Гольджи, расположенные в различных отделах клеток. Митохондрии имеют сферическую или овальную форму от 0,8 до 2 мкм в диаметре, небольшую численность крист и электронноплотный матрикс с митохондриальными гранулами. В цитоплазме гепатоцитов находятся включения гликогена и липидов. Гранулы гликогена местами образуют агрегаты в виде розеток, тогда как липидные гранулы имеют вариабельнную электронную плотность и не окружены мембранами. Ядра, как правило, расположены в центре гепатоцитов и имеют овальную или сферическую форму с просветленным хроматином. Ядра содержат 1-2 ядрышка и имеют широкопетлистую ретикулярную структуру (рис. 1).

Рис. 1. Печень интактной крысы. Фрагмент гепатоцита. Увеличение x 5000.

1 – ядро; 2 – ядрышки; 3 – митохондрии; 4 – канальцы эндоплазматической сети; 5 – включения гликогена.

Эндотелиоциты отделяют пространства синусоидов от пиресинусоидальних пространств и имеют продолговатую форму, а их ядра располагаются в центре. Вокруг полюсов ядра находится компактная зона органелл с цистернами комплекса Гольджи, канальцами агранулярной и гранулярной эндоплазматической сети и многочисленными митохондриями. Наибольшей протяженностью характеризуется периферийная зона, в которой расположены немногочисленные органеллы. Она содержит плазмолемные везикулы, связанные с базальной и адлюменальной поверхностями плазмолемы. В периферийной части эндотелиоцитов расположены фенестры, не затянутые диафрагмами. В месте контактов эндотелиоциты содержат многочисленные отростки, благодаря которым образуются ситообразные зоны в стенке синусоидов. Базальная мембрана вокруг эндотелиальных клеток не образует сплошного слоя, ее фрагменты выявляются вокруг периферической зоны эндотелиоцитов. В просветах синусоидов и между эндотелиоцитами расположены звездчатые макрофагоциты. Они имеют многочисленные псевдоподии и складки мембраны с ядрами бобовидной формы. Вблизи вогнутой поверхности ядра находятся цистерны комплекса Гольджи и многочисленные лизосомы. В просветах синусоидов обнаруживаются печеночные клетки-убийцы. Они имеют сферическую форму, электронноплотные ядра и своими отростками фиксируются к плазмолемме эндотелиоцитов. Их цитоплазма содержит гранулы с электронноплотным центром, а также фагоцитарные пузырьки. При ультраструктурном исследовании портальных триад обнаруживаются междольковые артерии, вены, желчные протоки, а также лимфатические сосуды. Стенка междольковых артерий состоит из трех оболочек. Во внутренней оболочке находится сплошной пласт эндотелиальных клеток, расположенных на базальной мембране. В подэндотелиальном слое расположены малодифференцированные клетки, эластичные и коллагеновые волокна. В междольковых артериях хорошо выражена внутренняя эластическая мембрана. Средняя оболочка включает 1-2 слоя гладких миоцитов. Внешняя оболочка состоит из адвентициальних клеток. Вокруг артерий расположены фибробласты, коллагеновые и эластичные волокна. В просветах междольковых вен иногда оказываются моноциты и лимфоциты. В средней оболочке гладкие миоциты не образуют сплошного слоя, их внешняя оболочка состоит из рыхлой соединительной ткани, а в периваскулярном пространстве расположены фибробласты, коллагеновые и эластичные волокна, а также одиночные лимфоциты. Стенка междольковых желчных протоков состоит из кубических клеток с электронно-светлой цитоплазмой и ядрами. Вокруг желчных протоков находятся фибробласты, коллагеновые и эластичные волокна, а также единичные лимфоциты.

Через 8 недель развития экспериментального СД нами отмечено увеличение численности и размеров жировых включений в цитоплазме гепатоцитов и уменьшение включений гликогена (рис. 2).

Рис. 2. Печень крыс через 8 недель после введения стрептозотоцина. Сб. × 7000.

1 – отек эндотелиоцитов; 2 – сладж эритроцитов в просвете синусоида; 3 – гиперплазия коллагеновых волокон в перисинусоидальных пространствах.

Возрастает число митохондрий и гетерогенность в структуре ядер. При этом встречаются сферические ядра со структурой хроматина и ядрышек, подобных интактным животным, но с увеличенной численностью гиперхромных ядер и конденсированным по краям хроматином. Перинуклеарные пространства вокруг таких ядер значительно расширены. Обнаруживаются гепатоциты с пикнотическими ядрами, которые имеют причудливую форму. Межклеточные пространства гепатоцитов видоизменены и расширены, в них выявляются коллагеновые фибриллы и фибробласты. Перисинусоидальные пространства расширены, заполнены коллагеновыми волокнами, среди которых обнаруживаются многочисленные фибробласты, звездчатые макрофагоциты и редко перисинусоидальные жиронакопительные клетки, в цитоплазме которых находятся гигантские удлиненные митохондрии червеобразной формы с многочисленными плотноупакованными кристами. Диаметры синусоидов сужены, часто встречается сладж эритроцитов, а также многочисленные звездчатые макрофагоциты и тромбоциты, которые контактируют с плазмолемой эндотелиоцитов. Эндотелиоциты в периферийной зоне утолщены. Их цитоплазма имеет неоднородную электронную плотность и содержит темные и светлые клетки, вакуоли, канальцы эндоплазматической сети, а также расширенные комплексы Гольджи и полиморфные митохондрии. Часто обнаруживаются просветленные митохондрии с деструктурированными кристами. Плазмолемальных везикул в таких клетках мало по сравнению с интактной группой животных. Ядра в эндотелиоцитах часто отечны, осмиофильные (рис. 3).

Рис. 3. Печень крыс через 8 недель после введения стрептозотоцина.

1 – сужение просветов синусоидов; 2 – утолщенные стенки синусоидов; 3 – базальная мембрана вокруг эндотелиоцитов.

Вокруг эндотелиоцитов обнаруживается базальная мембрана. В портальных трактах – выраженный склероз. Стенки артериол утолщены, эндотелиальная выстилка в них не сплошная. В средней оболочке наблюдаются процессы гипертрофии и гиперплазии гладких миоцитов. Стенка вен склерозирована и утолщена с наличием деструктивных фибробластов. Пространство желчных протоков расширено и заполнено остатками эпителиоцитов. Вокруг желчных протоков наблюдается гистиолимфоцитарная инфильтрация с отечными эндотелиоцитами и расширение диаметров лимфатических сосудов.

Через 10 недель эксперимента, наряду с вышеуказанными изменениями, отмечается увеличение числа деструктуризированых митохондрий и крупных жировых включений в гепатоцитах с уменьшением в них содержания гликогена (рис. 4).

Рис. 4. Печень крыс через 10 недель после введения стрептозотоцина. Сб. × 3000.

1 – деструкция митохондрий; 2 – выраженная жировая дистрофия цитоплазмы гепатоцитов.

Возрастает количество пикнотичных и формализованных ядер в гепатоцитах, расширяются их межклеточные и перисинусоидальные пространства и просветы в желчных капиллярах. Обнаруживаются разрастания коллагеновых волокон с гипертрофией и гиперплазией фибробластов. Возрастает численность снежных макрофагоцитов, суживаются синусоидальные капилляры и уменьшается численность перисинусоидальных жиронакопительных клеток. В них часто обнаруживается сладж эритроцитов и лейкоцитов. Эндотелиальные клетки в стенке синусоидных капилляров полиморфны. Их цитоплазма неоднородна с малым количеством органелл и деструктироваными митохондриями. Ядра часто выступают в просвет синусоидов, в них наблюдается маргинальная агрегация хроматина, ядрышки не определяются. Вокруг зоны органелл часто образуется базальная мембрана. В портальных трактах наблюдается склероз и гиперплазия фибробластов. При этом стенки междольковых артерий утолщены и склерозированы, в их просветах часто появляются пристеночные тромбы. Диаметры междольковых желчных протоков расширены, их стенки утолщены, лимфатические сосуды расширены.

Таким образом, на поздних этапах развития экспериментального СД происходят изменения в артериолах, характеризующиеся деструкцией эндотелиоцитов, гипертрофией и гиперплазией гладких миоцитов, сужением просвета и гиперплазией фибробластов в наружной оболочке артериол, а также гиперемией центральных и междольковых вен. В синусоидах, наряду с деструктивными изменениями в эндотелиоцитах, проходят процессы активации и увеличения численности макрофагоцитов и их миграция в перисинусоидальные пространства, что приводит к трансформации жиронакопительных клеток в фибробласты и разрастанию коллагеновых волокон. Расширение перисинусоидальных пространств приводит к утолщению барьера между кровью и гепатоцитами с последующим нарушением обмена веществ.

Рецензенты:

Матещук-Вацеба Л.Р., д.м.н., профессор кафедры нормальной анатомии Львовского национального медицинского университета им. Данила Галицкого, г. Львов.

Жилякова Е.Т., д.ф.н., профессор, зам. директора ООО «Асклепий», г. Белгород.

Источник