Масса органов лабораторных крыс весом 250 г

Токсикологические исследования. Референтные интервалы массовых коэффициентов внутренних органов на выборке, состоящей из 1000 аутбредных крыс

И.А. Луговик, фармаколог, ORCID 0000-0003-3840-5049;
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор, ORCID 0000-0003-3176-6386;

АО НПО «Дом Фармации»,
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245
Е-mail: lugovik.ua@doclinika.ru

Резюме

Измерение массы внутренних органов и подсчет их массовых коэффициентов относительно массы тела являются обязательной манипуляцией при исследовании токсических эффектов препаратов в доклинических исследованиях. Однако оценка клинической значимости изменений по массовым коэффициентам органов может быть осложнена при отсутствии корректных референтных внутрилабораторных интервалов, отражающих нормальные значения для популяции животных, используемых в исследовательском центре.

Цель данной работы – обобщение результатов морфометрических показателей органов, полученных в проведенных ранее исследованиях на аутбредных крысах на базе НПО «Дом Фармации» в период с 2018 по 2020 г. для выведения референтных значений показателей массы органов аутбредных крыс. Проведен ретроспективный анализ данных 9 основных органов, используемых для подсчета массовых коэффициентов при токсикологических исследованиях. Проанализирована большая выборка, состоящая из 1000 аутбредных крыс (534 самца и 466 самок), диапазон массы тела самцов 200–400 г, самок – 180–300 г.

Установлены референтные интервалы с учетом рекомендаций Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) для массовых коэффициентов сердца, легких, тимуса, печени, селезенки, почек, надпочечников, головного мозга, семенников и яичников.

Выявлено, что у самцов и самок крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких массовых коэффициентов внутренних органов, как селезенка (0,82–8,87%), надпочечники (0–6,45%), легкие (0–5,44%), семенники (0–4,69%) и яичники (0–3,12%), выбросы других показателей отмечались существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при оценке клинической значимости изменений данных показателей.

Определять актуальные внутрилабораторные референтные интервалы для массовых коэффициентов органов необходимо для того, чтобы на основании исторических данных лаборатории корректно оценивать влияние препарата, отделив его от действия случайных факторов (т.е. избежать ложноположительных или отрицательных результатов).

Целесообразно иметь референтные интервалы по массовым коэффициентам относительно не только массы тела, но и головного мозга, а также по абсолютным массам органов, так как в токсикологических исследованиях при значительных изменениях массы тела эти показатели могут дать более объективную информацию.

Формирование референтных интервалов по массовым коэффициентам целесообразно проводить для каждого диапазона масс тела животных отдельно, используя не менее 120 особей обоего пола на каждый диапазон. Для соблюдения этих условий предпочтительно использовать непрямой метод получения данных при ретроспективном анализе с целью соблюдения биоэтических норм.

Введение

Крысы являются одним из самых часто используемых модельных организмов в биомедицинских исследованиях.
Так, согласно последнему отчету Европейского союза об использовании животных в научных целях, крысы находились на 2-м месте по общему количеству задействованных животных – 1 146 299 особей за 2017 г. [1]. Небольшая масса белых крыс, относительно простое содержание и успешное разведение их в лабораторных условиях позволяют успешно проводить доклинические исследования [2].

Измерение массы внутренних органов и подсчет их массовых коэффициентов относительно массы тела являются обязательной манипуляцией при исследовании токсических эффектов препаратов в доклинических исследованиях [2]. Массовый коэффициент органов (МКО) – процентное отношение массы органа к массе тела, интегральный показатель, используемый в токсикологии для оценки состояния внутренних органов. Изменения МКО отражают объективное состояние внутренних органов и их поражение ксенобиотиками, а также позволяют обнаружить эндокринно-связанные эффекты [3]. Для изучения воздействия препарата на внутренние органы чаще всего используются сравнение с контрольной группой и обработка этих изменений с помощью статистических методов для определения их значимости. Однако не всякое статистически значимое изменение имеет прогностическое значение и в ряде случаев для оценки клинической значимости отклонений могут потребоваться дополнительные ориентиры. Одним из таких ориентиров могут служить референтные интервалы (РИ).

РИ – статистический показатель, двумя пределами ограничивающий центральный 95% диапазон референтных значений [4]. Этот показатель определяют на выборке условно здоровых людей или животных, для того чтобы установить статистические нормы по какому-либо показателю, который характеризует данную популяцию [5].

Согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), в каждой лаборатории должны создаваться свои РИ [5]. Крысы как биологический вид также не являются однородными, существует более 1 тыс. линий крыс, которые могут значительно отличаться по многим признакам, в том числе морфометрическим [6]. В связи с этим остро встала необходимость составления актуальных РИ для популяции животных, используемых для проведения исследований в НПО «Дом Фармации»

Существует два основных метода для расчета пределов РИ: параметрический и непараметрический.

При использовании непараметрического метода расчета РИ требуется минимум 120 показателей [5], а параметрического – уже ≥200, так как при анализе около 150 значений и ниже параметрический метод нестабилен [7]. Также непараметрический метод не требователен к распределению данных, что делает его предпочтительным при создании РИ биологических показателей, которые зачастую имеют ненормальное распределение [4].

В зависимости от того, как были получены данные для расчета РИ, выделяют прямой и непрямой методы их определения. При прямом методе оценки предполагается целенаправленный набор здоровых субъектов. При непрямом методе используется информация, накопленная в базах данных исследовательского учреждения [5].

Применительно к расчету РИ, используемых в клинической практике, приоритет имеет прямой метод. Однако в случае расчета РИ на биологических моделях по показателям масс внутренних органов, при фиксации которых требуется эвтаназия, гуманное обращение с животными требует непрямого ретроспективного метода.

Цель данной работы – обобщение результатов морфометрических показателей органов, полученных в проведенных ранее доклинических испытаниях на аутбредных крысах на базе НПО «Дом Фармации» в период с 2018 по 2020 г. для выведения референсных значений показателей массы органов аутбредных крыс.

Материал и методы

Поскольку количество животных на каждый диапазон массы тела было начала 2018 г. до середины 2020 г. (все проведенные эксперименты были одобрены биоэтической комиссией).
В сформированном массиве представлены данные, полученные от 1000 аутбредных крыс (534 самца и 466 самок), масса тела самцов – 200–400 г, самок – 180–300 г. При оценке показателей данные животных были разделены на группы по массе (4 группы – для самцов и 3 группы – для самок) так, чтобы в каждой группе, в которой оценивали МКО, оказались крысы сопоставимого возраста и морфометрических характеристик. Данные, касающиеся самцов, были разделены на 4 группы в массовых диапазонах 200–250, 251–300, 301–350 и 351–400 г; самок – на 3 группы по массам: 180–220, 221–260 и 261–300 г. Были использованы небеременные и нерожавшие самки. Животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 18–26 о С, относительная влажность 46–65%, 12-часовой световой день. Крысы находились в стандартных пластиковых клетках, не более 5 животных в каждой. Площадь пола на одно животное соответствовала регламентирующим стандартам, доступ к воде не ограничивали на протяжении всего срока эксперимента. Кормление животных проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Все исследования были выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Всех животных, данные которых были отобраны для исследования, подвергали эвтаназии с применением СО₂ с последующим удалением жизненно важных органов (легкие, сердце, головной мозг) или обескровливанием полостей сердца.

Животных лишали корма на ночь перед некропсией, оставляя свободный доступ к воде. Массу тела определяли непосредственно перед некропсией. Рассчитывали процентное отношение массы органа к массе тела, определенной непосредственно перед некропсией, а также к массе мозга.

Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica 10.

Результаты и обсуждение

Опираясь на процедуру, описанную в руководстве CLSI, из массива данных были устранены аномальные значения – статистические выбросы. Их определяли отдельно по каждому показателю для каждого пола и группы, согласно диапазону масс по методу Тьюки [5]. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5.IQR)–(Q3+1,5.IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или «жесткие» выбросы, так и «outliers», или «мягкие» выбросы (табл. 1, 2).

Обращает на себя внимание, что наиболее часто у самцов и самок крыс встречаются выбросы по таким показателям, как «легкие», «селезенка», «надпочечники», «семенники» и «яичники», что необходимо учитывать при анализе данных доклинических исследований (см. табл. 1, 2).

После устранения статистических выбросов были получены результаты для составления РИ.

Согласно руководству CLSI для данных по массовым коэффициентам органов, проводился расчет промежутка 2,5–97,5 процентили, диапазон между которыми и служил РИ [4] (табл. 3, 4).

Для самок в свою очередь определяли МКО в диапазонах массы тела – 180–220, 221–260 и 261–300 г.

Полученные данные демонстрируют, что относительно массы тела у самцов и самок наблюдалось постепенное снижение массовых коэффициентов всех исследованных органов. Это было связано с физиологическим приростом массы тела животных за счет мышечной и жировой тканей.

Поскольку в токсикологических исследованиях часто наблюдается изменение нормальной динамики массы тела (например, существенное снижение на фоне действия ксенобиотика), иногда целесообразно оценивать как абсолютную массу органов, так и ее отношение к массе головного мозга – органа, наименее подверженного индуцированным колебаниям массы тела. Исходя из этого, были составлены РИ по МКО относительно головного мозга (табл. 5, 6) и абсолютных значений органов (табл. 7, 8).

С помощью метода Тьюки были устранены статистические выбросы согласно процедуре, описанной выше, и рассчитана их доля (табл. 9–12)

Следует отметить, что доля статистических выбросов при расчете МКО относительно массы тела (0–5,11%) была соотносима с данными, полученными при расчете статистических выбросов МКО относительно головного мозга (0–8,87%) и абсолютных масс органов (0–7,03%). Наибольшее количество выбросов наблюдалось по таким показателям, как «селезенка», «легкие», «надпочечники», «семенники» и «яичники».

При исключении выбросов в группе самцов массой 200–250 г количество оставшихся значений для расчета РИ по показателю «селезенка» было меньше 120, и соответственно расчет не в полной мере отвечает рекомендациям CLSI и является ориентировочным.

При исключении выбросов в группе самцов массой 351–400 г и самок массой 261–300 г количество оставшихся значений для расчета РИ было меньше 120, и соответственно расчет не в полной мере отвечает рекомендациям CLSI и является ориентировочным.

Заключение

Наличие актуальных внутрилабораторных референтных интервалов необходимо, так как позволяет на основании исторических данных лаборатории корректно оценить влияние препарата, отделив его от случайных факторов (т.е. избежать ложноположительных или отрицательных результатов).

Необходимо отметить, что целесообразно иметь референтные интервалы по массовым коэффициентам органов не только относительно массы тела, но и головного мозга, а также по абсолютным массам органов, так как в токсикологических исследованиях при значительных изменениях массы тела эти показатели могут дать более объективную информацию.

Также важно отметить, что лучше рассматривать референтные интервалы по массовым коэффициентам для каждого массового диапазона (по массе тела) отдельно, используя при составлении не менее 120 животных обоего пола на каждый диапазон. Для соблюдения этих условий предпочтительно использовать непрямой метод получения данных при ретроспективном анализе с целью соблюдения биоэтических норм.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Луговик И.А. – сбор и анализ данных, сбор данных из литературных источников, написание текста статьи.

Макарова М.Н. – идея исследования, редактирование текста статьи.

Источник

Динамика массы тела лабораторных мышей в зависимости от типа корма и режима кормления

М.В. Лопатина, старший лаборант,
Е.Н. Петрицкая, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник,
А.Л. Ивлиева, младший научный сотрудник

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского
129110, Россия, Москва, ул. Щепкина, д. 61/2
Е-mail: lopatina@medphyslab.com

Резюме

В экспериментах по изучению действия различных токсических веществ и фармацевтических препаратов обязательно проводится исследование тканей внутренних органов и оценка содержания исследуемого вещества в них. Так при обработке результатов нужно определять массу внутренних органов, нельзя допускать набора животными избыточной массы тела. В связи с этим было оценено влияние разных типов кормов и разных их суточных количеств на динамику массы тела лабораторных мышей. В 1-м эксперименте животные были разделены на 4 группы: 2 группы получали комбикорм, 2 другие – свежие корма. В каждой из двух пар групп в одной из них мыши получали дневную норму корма, согласно официальным положениям о кормлении лабораторных животных (1-я и 3-я группы), в другой – корм в неограниченном количестве (2-я и 4-я группы). Во 2-м эксперименте было две группы животных, потреблявших комбикорм и свежие корма соответственно: суточное количество корма на мышь составило ¾ от дневной нормы (ограниченно-нормированное количество). При любом из указанных выше количеств корма его тип влиял на набор животными массы тела: мыши, потреблявшие комбикорм, набирали массу тела быстрее, чем получавшие свежие корма. Различий в наборе массы тела при кормлении дневной нормой корма и предоставлением животным неограниченного доступа к корму не было: таким образом, включенная в рекомендации по кормлению лабораторных животных дневная норма избыточна по отношению к действительному суточному потреблению животными корма. При введении ограниченно-нормированного суточного количества корма животные набирали массу тела: таким образом, уменьшенное до ¾ от дневной нормы суточное количество корма остается превышающим (или равным таковому) действительное суточное потребление животными корма. При этом финальная масса тела у животных, потреблявших комбикорм и свежие корма, была сходна, что может указывать на отсутствие набора мышами избыточной по сравнению с возрастной нормой массы тела. Таким образом, для снижения вероятности набора животными избыточной массы тела при разработке дизайна эксперимента с животными возрастом >2 мес необходимо выбирать суточное количество корма, уменьшенное по сравнению с рекомендуемой дневной нормой, при любом типе корма.

Введение

Состояние отобранных для проведения медико-биологического научного эксперимента лабораторных животных – их внешний вид, здоровье, генетическая однородность, а также условия ухода, содержания и кормления во многом предопределяют фактические результаты, а также выводы экспериментальной работы. Во многих экспериментах, особенно по изучению токсического действия различных веществ и фармацевтических препаратов, необходимо определять концентрацию исследуемого вещества в тканях внутренних органов животного. при кормлении животные нередко набирают избыточную по сравнению с возрастной нормой массу тела, при вскрытии наблюдается ожирение внутренних органов.

Согласно отраслевым документам, при кормлении лабораторных животных необходимо пользоваться указанными в них кормовыми нормами [1, 2]. Однако дневная норма корма на 1 животное, указанная в документах, определена как количество корма, потребляемое животным за 1 сут, как количество корма, которого животному будет на 1 сут достаточно. Таким образом, норма корма не тождественна количеству потребленного животным корма и превышает таковое. Из-за этого при планировании экспериментов чувствительных к массе животных и/или к ее динамике при применении дневных норм корма может существовать риск набора животными избыточной массы тела из-за обилия корма, что может привести к искажению получаемых данных.

Цель исследования – определить влияние нормированного и неограниченного, а также ограниченно-нормированного (уменьшенного на ¼) суточного количества корма на динамику набора массы тела лабораторными животными при разных типах корма – комбикорм и свежий корм.

Материал и методы

Эксперименты проводились на 20 белых мышах линии SHK, самцах (питомник «Столбовая», Россия). Животные содержались в виварии МОНИКИ в стандартных условиях в соответствии с требованиями ГОСТ 33216-2014 [3]. Соблюдены все условия работы с животными, согласно международным нормам (Council of the European Communities Directive 86/609/EES) и Приказу Минздрава СССР №755 от августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных форм».

В 1-м эксперименте животные были разделены на 4 группы по 5 мышей в каждой: 2 группы получали комбикорм, 2 другие – свежие корма. В каждой из двух пар групп в одной из них мыши получали дневную норму корма (1-я и 3-я группы), в другой – корм в неограниченном количестве (2-я и 4-я группы). Дневная норма корма соответствовала указаниям Приказа Министерства здравоохранения СССР [1] и составила на 1 животное 7 г комбикорма, либо 10 г смеси злаков (овес, геркулесовые хлопья, просо, белый хлеб в произвольном соотношении) вместе с 2 г свежих овощей (морковь, капуста). Показатели качества комбикорма и его изготовление – по ТУ 9296-007-50199293 (состав: сырой протеин – 22% , сырая клетчатка – 5%, сырой жир – не менее 5%, метионин+цистин – 0,80%, лизин – 1,3%). Комбикорм («Лабораторкорм», полнорационный экструдированный) сбалансирован по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам, не содержит консервантов и нитратов.

Мыши были взвешены и рассажены в клетки по 1 особи. Каждые сутки, в начале каждого дня (кроме субботы и воскресения – в субботу животным выдавали корма на 2 суток) остатки корма убирали и давали мышам новую порцию корма. Эксперимент длился 24 дня, в течение которых было проведено 7 взвешиваний животных, помимо начального. Взвешивали мышей 2 раза в неделю, в понедельник в пятницу (т.е. 1 раз в 3 или 4 сут), до выдачи нового корма.

Во 2-м эксперименте животные были разделены на 2 группы по 10 мышей в каждой: в 1-й группе мыши получали комбикорм, во 2-й – свежий корм. Для каждого типа корма соответствующая дневная норма была сокращена на ¼, т.е. составила 5,25 г комбикорма и 7,5 г смешанного корма и 2 г овощей. Мыши были взвешены и рассажены по 1. Эксперимент длился 1 мес: кроме начального, было проведено 4 измерения массы тела с недельным интервалом между ними.

Статистический анализ был проведен в программе Statistica 8.0 (StatSoft). Сравнение финальной массы тела между группами комбикорма и свежих кормов и между группами с нормированным и ограниченно-нормированным количеством корма проведено по критерию Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при p 0,1). Масса тела возрастает сначала резко, к концу эксперимента — более плавно: прирост массы тела между 4-м днем эксперимента и начальным значением составил в группе комбикорма 7,0±1,03 г, в группе свежих кормов — 4,21±1,02 г, а между 24-м и 20-м днями — соответственно 1,40±2,45 г в группе комбикорма и 0,75±0,86 г в группе свежих кормов (рис. 1).

Во 2-м эксперименте употребление ограниченно-нормированного количества корма – в группе, получавшей только комбикорм, в группе, употреблявшей только свежий корм – приводило к увеличению массы тела в обеих группах (рис. 2). Начальная средняя масса тела по всей выборке составила 18,1±0,42 г. Внешних и поведенческих нарушений при урезанной норме корма в каждой из 2 сравниваемых групп не наблюдалось.

Мыши, получавшие комбикорм, набирали массу тела быстрее, чем те, кому давали свежий корм: так, прирост массы тела между 1-м и 2-м измерением в группе комбикормов составил 6,21±1,77 г, в группе свежих кормов – 4,79±1,67 г (см. рис. 2). Однако в конце эксперимента прирост массы тела снизился в обеих группах: между измерением 3-й недели и финальным измерением он составил в группе комбикорма 1,23±1,18 г, в группе свежих кормов — 2,58±2,86 г. В обеих группах финальная масса тела была примерно одинакова: 31,7±2,30 г — в группе комбикорма и 30,2±3,89 г — в группе свежих кормов.

Тип получаемого животными корма влиял на набор ими массы тела при каждом из выбранных в 2 экспериментах его суточных количеств: мыши, потреблявшие комбикорм, набирали массу тела быстрее, чем получавшие свежие корма. Различий в наборе массы тела при кормлении дневной нормой корма и предоставлением животным неограниченного доступа к корму не было найдено, следовательно, включенная в рекомендации по кормлению лабораторных животных дневная норма избыточна по отношению к действительному суточному потреблению животными корма.

После уменьшения дневной нормы корма на ¼, т.е. введения ограниченно-нормированного суточного количества корма, при каждом типе корма животные набирали массу тела, у них не наблюдалось нарушений во внешности или поведении. Таким образом, урезание количества корма до ¾ рекомендованной дневной нормы оказалось безопасным для животных, и можно допустить, что по-прежнему превышающим (или равным таковому) действительное суточное потребление животными корма. Кроме того, сходство финальной массы тела у мышей, потреблявших разные корма, может указывать на отсутствие набора животными избыточной по сравнению с возрастной нормой массы тела: динамика массы тела может отражать только возрастные изменения, не набор лишнего веса из-за избыточного кормления. В таком случае по достижении 2-месячного возраста масса тела при обоих типах корма может оставаться примерно одинаковой.

Заключение

При выборе типа корма и разработке дизайна эксперимента с животными возраста >2 мес можно руководствоваться экономической целесообразностью для конкретного вивария, потому что динамика массы тела животных определяется не типом корма, а выбранной его суточной нормой. Если в эксперименте масса тела животных играет значимую роль, необходимо ограничить суточное потребление ими корма: показано, что уменьшение суточного количества корма до ¾ от рекомендованной дневной нормы не отразится на здоровье животных и позволит снизить или вовсе исключить вероятность набора избыточной по сравнению с возрастной нормой массы тела.

Источник