Норма лейкоцитов для крыс

Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: крысы

Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии,
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор,
А.А. Зуева, токсиколог

АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»,

188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245

Резюме

Установление корректных референсных интервалов для лабораторных показателей актуально как в клинической практике, так и при проведении исследований на животных. Проведен ретроспективный анализ данных по 11 биохимическим показателям сыворотки крови крыс на большой выборке животных (196 самцов и 184 самки крыс, в возрасте 12–20 нед, массой 250–350 г).

Установлено, что в крови крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), выбросы других показателей, существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при планировании исследований, что требует увеличения числа повторностей при проведении анализа показателей.

Установлены референсные интервалы для креатинина, мочевины, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глюкозы и общего билирубина. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (более 30%) установлена для таких показателей, как активность щелочной фосфатазы, уровень триглицеридов, глюкозы и общего билирубина.

Проведено сравнение полученных в ходе ретроспективного анализа данных с референсными интервалами биохимических показателей крови крыс различных линий из 3 крупных питомников (Charles River, Taconic и Envigo). Представленные в литературе референсные интервалы также свидетельствуют о высокой вариабельности активности ряда ферментов (в том числе щелочной фосфатазы), а также концентрации глюкозы, общего билирубина и триглицеридов в крови крыс. Рассчитанные нами референсные интервалы хорошо сопоставимы с данными, представленными в литературе.

Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительном использовании именно ретроспективного анализа данных, который позволяет получить более корректные референсные интервалы на большей выборке животных, без ущерба для этических принципов. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови крыс и человека демонстрирует наличие видовых различий, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.

Введение

Биохимический анализ крови – неотъемлемая часть доклинических исследований, проводимых на лабораторных животных. В большинстве случаев дизайн эксперимента предусматривает сравнение показателей животных из интактных и подопытных групп. Число животных в группе, как правило, не превышает 10, что, с точки зрения статистики, является малой выборкой [1]. Для заключения о наличии/отсутствии клинической значимости наблюдаемых отклонений необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов (РИ).

В клинической практике применяют несколько способов установления РИ. Классический подход – формирование референсной группы с применением строгих правил включения и исключения, обследование и последующий расчет РИ. Это является трудоемким и дорогостоящим процессом для медицинских учреждений, а в доклинических исследованиях еще и противоречит нормам биоэтики, так как для установления РИ в каждой половой или возрастной группе требуется не менее 120 наблюдений [2, 4]. Другой подход – апостериорный (ретроспективный) – позволяет использовать для расчета РИ результаты, ранее полученные в данной лаборатории, за определенный период времени. Также на практике прибегают к данным в справочной литературе, что в доклинических исследованиях оправдано при анализе новых или редко используемых показателей или экзотических видов лабораторных животных.

В связи с изложенным, цель нашей работы – установление референсных интервалов для основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и оценка частоты статистических выбросов для этих показателей. Для установления РИ был выбран ретроспективный метод, что позволило включить в массив данных большое число животных, не нарушая при этом биоэтические принципы. Крысы являются одним из самых востребованных тест-систем. Поэтому мы рассматриваем вопрос установления РИ биохимических показателей на примере этих животных.

Материал и методы

Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в период проведения текущих исследований с октября 2018 по октябрь 2019 г. В массив данных включали животных интактных групп из 26 исследований, возраст самцов и самок аутбредных крыс составлял 12–20 нед, масса тела – 250–350 г (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). В сформированном массиве находились данные, полученные ранее от 196 самцов и 184 самок крыс. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Испания) были рассчитаны следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов Вектор-Бест (Россия), остальные аналиты – с помощью наборов Bio Systems (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна Уитни и t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5•IQR)-(Q3+1,5•IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.

После исключения выбросов массивы данных были проанализированы на соответствие действующим в центре РИ. Последние были рассчитаны с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (20 голов – 10 самцов и 10 самок). Данные о доле статистических выбросов, в том числе «extremes», по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.

Доли статистических выбросов и отклонений от действующих РИ

Источник

Норма лейкоцитов для крыс

В медицинской биотехнологии постановка экспериментов при помощи моделирования патологических состояний, например ожогового повреждения кожи, имеет огромное значение для глубокого исследования крови и кроветворных органов [3]. Исходя из этого, необходимо тщательное и всестороннее изучение всех изменений, которые происходят в организме при этих воздействиях. Главным образом это относится к системам поддержания гомеостаза [2].

Ожоговые поражения кожи стали в современном мире одним из наиболее социально значимых и распространенных типов травматических повреждений у человека. Изучению вопроса реакции клеток крови на ожоги посвящен ряд исследований [1, 8].

Любое заболевание, патологический процесс, а также ряд физиологических сдвигов могут в той или иной степени отразиться на количественных и качественных особенностях состава циркулирующей крови [5]. Этим и определяется огромное значение необходимости изучения крови. Белые клетки крови, имея высокую реактивность, быстро включаются в адаптационные реакции. Они способны к неспецифическому реагированию в ответ на альтерирующие воздействия.

Термическая травма сопровождается развитием интоксикации. Кровь в первую очередь подвергается действию токсических веществ, возникших в очаге поражения [1].

Свой вклад в общее состояние системы организма вносят компоненты крови. Наиболее уязвимым объектом для действия продуктов свободнорадикального окисления липидов является стенка кровеносных сосудов, что обусловлено высоким уровнем кислорода в крови и низким уровнем его утилизации [9]. В условиях патологического процесса происходит поражение неклеточного компонента сосудистой стенки.

Цель исследования – изучение показателей периферической крови половозрелых крыс в норме и в условиях термического воздействия.

Материалы и методы. Объектом исследования явились 50 беспородных крыс-самцов 4-месячного возраста. Во время эксперимента регистрировали общее состояние и поведение животных. Самцы крыс были разделены на пять групп по типу воздействия:

I группа – животные, не подвергшиеся ожоговому воздействию (контрольная, 10 шт.);

II группа – животные, получившие ожоговое воздействие и не подвергшиеся терапии (10 шт.). Раны регенерировали естественным путем;

III группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии спреем «Д-Пантенол» (10 шт.);

IV группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии бальзамом мазевой формы «Спасатель» (10 шт.);

V группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии аппликациями настойки календулы (10 шт.).

Исследование морфологических и биохимических показателей периферической крови заключалось в определении количества лейкоцитов, количества эритроцитов, лейкоцитарной формулы, уровня гемоглобина, перекисной резистентности эритроцитов.

Уровень гемоглобина в образцах крови крыс определяли электрофотометрическим способом на гемоглобинометре APEL Hemoglobinmeter HG-202. Мазки фиксировали и окрашивали по Романовскому – Гимзе. Идентификация форменных элементов крови проводилась согласно методике Н. Т. Ивановой [4]. Количество эритроцитов крови подсчитывали по стандартной методике в камере Горяева. Количество лейкоцитов считали по мазкам крови крыс.

Для оценки уровня свободнорадикального окисления и выраженности в связи с этим липолитических процессов в крови проводили измерение перекисной резистентности эритроцитов. Перекисный гемолиз эритроцитов является чувствительным показателем, отражающим про– и антиоксидантный баланс организма [6].

Для определения перекисного гемолиза эритроцитов использовали модификацию методов определения степени перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) А. А. Покровского и А. А. Абразцова [7], которую предложили А. Е. Лазько, Р. И. Асфандияров и А. А. Резаев [4].

Результаты исследования и их обсуждение. Анализ гематологических исследований экспериментальных животных показал, что наиболее высокий уровень гемоглобина периферической крови наблюдался у крыс, лечившихся бальзамом «Спасатель» и спреем «Д-пантенол», что наглядно отображено в таблице 1. В группе крыс, лечившихся настойкой календулы, данный показатель незначительно отличался от значений у обожженных животных, не получавших лечения.

Гематологические показатели через 3 суток после ожоговой травмы

Источник

Лейкоциты в крови: норма у женщин, мужчин и детей

Лабораторное определения количества лейкоцитов в крови — основной метод современного диагностического поиска. По росту уровня концентрации лейкоцитарных клеток в плазме можно судить о состоятельности иммунитета и степени готовности его фагоцитоза — иммунной защиты организма.

Что такое лейкоциты?

Лейкоциты — это один из основных форменных элементов крови (эритроциты, тромбоциты, лейкоциты), каждый из которых выполняет определенные функции. Хотя клетки лейкоцитов и окрашены в розово-фиолетовый цвет, их еще называют белой кровью. Функция лейкоцитарных клеток — иммунный фагоцитоз (защита организма от неблагоприятного воздействия).

Секреция защитных клеток происходит в костном мозге и лимфоузлах. Они включают в себя 5 подгрупп (разновидностей), образуя лейкоцитарный ряд из клеток нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов, различных по внешнему виду и «возложенных» на них функциях.

Основное их назначение:

• обнаружение инородных внедрений в организме;

• распознавание по системе — свой, чужой;
• обеспечение иммунной памяти путем «знакомства» молодых клеток с собранной информацией;
• уничтожение патогена — локальным окружением, пожиранием и внутриклеточным растворением

1. В функции зрелых и юных нейтрофилов (сегментоядерных и палочкоядерных) входит уничтожение бактериальных патогенов, обнаруженных в плазме крови. Они способны поражать «пришельцев» в очагах инфекции, выходя за пределы кровотока.
2. Эозинофилы — уникальные клетки, способны выявить и нейтрализовать онкологические клетки, токсичные медиаторы, поддерживающие реакции воспаления, уничтожить аллергенного, инфекционного и паразитарного разносчика.
3. Базофилы работают в «команде» со всеми лейкоцитарными представителями, помогая выявлению и препятствуя распространению по организму чужеродных объектов. Они способны подавлять аллергены, нейтрализовать действие ядов и токсинов.
4. Моноциты — санитары. Именно они пожирают и растворяют «чужаков».

Клетки лимфоцитов выполняют самую важную функцию — ответственны за иммунную память и весь иммунитет в целом, препятствуют развитию повторных заболеваний, вырабатывая к ним антитела. Основная их функция – обеспечение специфического иммунного ответа.

Анализируя соотношение и поведение различных клеток иммунного фагоцитоза, можно выявить любые реакции воспаления в организме.

Какова допустимая норма концентрации лейкоцитов в крови?

Количество лейкоцитарных защитников в плазме крови способно значительно меняться на протяжение суток. Их концентрация зависит от калорийности питания и возраста человека. В детской крови, как правило, лейкоцитов больше. Но, как подтверждают отечественные и зарубежные исследования, от гендерной (мужчина или женщина) принадлежности их концентрация в крови не зависит.

Рассмотрим референсные значения (допустимые) лейкоцитов у здоровых людей по принятым ВОЗ протоколам, согласно возрасту.

Уровень лейкоцитов, 109 клеток/л

Дети старше 16 лет

Примечательно, что у пациентов старше 60 лет повышение уровня лейкоцитарных клеток практически не проявляется, что связано с возрастным снижением иммунных функций.

При лабораторном мониторинге крови пациентов, количество лейкоцитов рассчитывается относительно общих показателей иммунных клеток. Проводя оценку данных лабораторных исследований, референсные значения сопоставляются с возрастом пациентов.

Диагностический показатель обусловлен дисбалансом отклонений референсных показаний одной из форм разновидности фагоцитарных клеток, их уровня повышения, либо снижения лейкоцитов в плазме крови в общем.

Причины повышения лейкоцитов

Повышенный уровень клеток иммунной защиты в крови медицине известен, как лейкоцитоз. Физиологическая его форма может отмечаться у любого человека, что не связано с расстройством здоровья или развитием какой-либо патологии в организме.

Как правило, лейкоцитоз — это временное явление. У маленьких детей часто проявляется, как ответная реакция организма на новый рацион питания. У взрослых пациентов признаки повышенной секреции лейкоцитов могут быть обусловлены:

• длительным пребыванием на солнце;
• тяжелыми физическими нагрузками;
• стрессовым состоянием;
• сменой места проживания с измененным поясным временем;
• изменением погоды;
• последним триместром беременности, либо началом цикла менструаций.

При данных обстоятельствах, лейкоцитарный дисбаланс незначительный и особой тревоги вызывать не должен. Тревожным сигналом является превышение верхних границ нормы в 2 раза. Хотя это и относится к проявлениям иммунного фагоцитоза, такой дисбаланс можно считать патологией и обратиться за консультацией к врачу.
Под действием каких-либо нагрузок организм человека непроизвольно готовиться к обороне. Повышая концентрацию лимфоцитов, иммунная система формирует защитный барьер для нейтрализации возможной патогенной угрозы.

Если причина лейкоцитоза физиологическая, увеличение концентрации всех групп лейкоцитов в крови происходит одновременно и пропорционально. Если их рост спровоцирован развитием патологических процессов в организме, пропорции будут нарушены.

О чем может рассказать повышение лейкоцитов?

Специфических (отличительных) признаков увеличения фагоцитарных защитников иммунитета не существует. Лейкоцитоз в анализах — это своеобразный маркер развития патологических реакций в организме.

• Увеличенная концентрация нейтрофилов — свидетельство возможного развития в организме острых воспалительных и интоксикационных процессов, наличия бактериальной инфекции, внутренних геморрагий (кровотечений), шокового, либо инфарктного состояний. Наивысший их уровень отмечается при наличии сепсиса, туберкулезного инфицирования, развитии в костном мозге злокачественных процессов.
• Повышение уровня эозинофилов — это своеобразный маркер лекарственной несовместимости, либо показатель развития аллергических процессов. Нередко концентрация эозинофилов повышается при скарлатине у детей.
• Базофильный лейкоцитоз — частое проявление при беременности, что является вариантом нормы. Но, отмечается и у пациентов с заболеваниями ЖКТ и селезенки, при эндокринных патологиях (в частности при поражении щитовидной железы).
• Высокий лимфоцитарный уровень — может говорить о развитии тяжелой формы туберкулеза, гепатита «С» или вирусных инфекций. Подобное проявление характерно при заболеваниях, которые поражают человека всего однажды — ветрянка, корь, краснуха и пр.
• Повышенную концентрацию моноцитарных белых клеток провоцируют — хроническое течение туберкулезной инфекции, инфекционные патологии в конечном периоде болезни, определенные формы онкологических заболеваний.

Удивительно, но медицинской «панацеи» от повышения концентрации лейкоцитов в структуре крови — не существует. Лейкоцитоз — не заболевание, которое необходимо лечить. Это лишь следствие патологических процессов, развивающихся в организме. После устранения основного причинного фактора, вызвавшего лейкоцитоз, баланс клеток иммунного фагоцитоза быстро нормализуется самостоятельно.

Источник