Нормальные биохимические показатели крови крыс

Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: крысы

Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии,
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор,
А.А. Зуева, токсиколог

АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»,

188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245

Резюме

Установление корректных референсных интервалов для лабораторных показателей актуально как в клинической практике, так и при проведении исследований на животных. Проведен ретроспективный анализ данных по 11 биохимическим показателям сыворотки крови крыс на большой выборке животных (196 самцов и 184 самки крыс, в возрасте 12–20 нед, массой 250–350 г).

Установлено, что в крови крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), выбросы других показателей, существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при планировании исследований, что требует увеличения числа повторностей при проведении анализа показателей.

Установлены референсные интервалы для креатинина, мочевины, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глюкозы и общего билирубина. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (более 30%) установлена для таких показателей, как активность щелочной фосфатазы, уровень триглицеридов, глюкозы и общего билирубина.

Проведено сравнение полученных в ходе ретроспективного анализа данных с референсными интервалами биохимических показателей крови крыс различных линий из 3 крупных питомников (Charles River, Taconic и Envigo). Представленные в литературе референсные интервалы также свидетельствуют о высокой вариабельности активности ряда ферментов (в том числе щелочной фосфатазы), а также концентрации глюкозы, общего билирубина и триглицеридов в крови крыс. Рассчитанные нами референсные интервалы хорошо сопоставимы с данными, представленными в литературе.

Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительном использовании именно ретроспективного анализа данных, который позволяет получить более корректные референсные интервалы на большей выборке животных, без ущерба для этических принципов. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови крыс и человека демонстрирует наличие видовых различий, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.

Введение

Биохимический анализ крови – неотъемлемая часть доклинических исследований, проводимых на лабораторных животных. В большинстве случаев дизайн эксперимента предусматривает сравнение показателей животных из интактных и подопытных групп. Число животных в группе, как правило, не превышает 10, что, с точки зрения статистики, является малой выборкой [1]. Для заключения о наличии/отсутствии клинической значимости наблюдаемых отклонений необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов (РИ).

В клинической практике применяют несколько способов установления РИ. Классический подход – формирование референсной группы с применением строгих правил включения и исключения, обследование и последующий расчет РИ. Это является трудоемким и дорогостоящим процессом для медицинских учреждений, а в доклинических исследованиях еще и противоречит нормам биоэтики, так как для установления РИ в каждой половой или возрастной группе требуется не менее 120 наблюдений [2, 4]. Другой подход – апостериорный (ретроспективный) – позволяет использовать для расчета РИ результаты, ранее полученные в данной лаборатории, за определенный период времени. Также на практике прибегают к данным в справочной литературе, что в доклинических исследованиях оправдано при анализе новых или редко используемых показателей или экзотических видов лабораторных животных.

В связи с изложенным, цель нашей работы – установление референсных интервалов для основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и оценка частоты статистических выбросов для этих показателей. Для установления РИ был выбран ретроспективный метод, что позволило включить в массив данных большое число животных, не нарушая при этом биоэтические принципы. Крысы являются одним из самых востребованных тест-систем. Поэтому мы рассматриваем вопрос установления РИ биохимических показателей на примере этих животных.

Материал и методы

Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в период проведения текущих исследований с октября 2018 по октябрь 2019 г. В массив данных включали животных интактных групп из 26 исследований, возраст самцов и самок аутбредных крыс составлял 12–20 нед, масса тела – 250–350 г (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). В сформированном массиве находились данные, полученные ранее от 196 самцов и 184 самок крыс. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Испания) были рассчитаны следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов Вектор-Бест (Россия), остальные аналиты – с помощью наборов Bio Systems (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна Уитни и t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5•IQR)-(Q3+1,5•IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.

После исключения выбросов массивы данных были проанализированы на соответствие действующим в центре РИ. Последние были рассчитаны с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (20 голов – 10 самцов и 10 самок). Данные о доле статистических выбросов, в том числе «extremes», по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.

Доли статистических выбросов и отклонений от действующих РИ

Источник

Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 4: мыши

М.В. Мирошников, кандидат медицинских наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии, ORCID 0000-0002-9828-3242;
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор, ORCID 0000-0003-3176-6386

АО «НПО «Дом Фармации»
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволжский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245
Е-mail: miroshnikov.mv@doclinika.ru

Резюме

В статье представлены результаты изучения и анализа референсных интервалов биохимических показателей крови мышей – одной из ключевых тест-систем, используемых на доклиническом этапе исследования лекарственных веществ. Данные получены в центре АО «НПО «Дом Фармации» в период с января 2018 г. по декабрь 2019 г. в ходе мониторинга здоровья животных. В проанализированном массиве находились данные от 100 самцов и 100 самок (небеременные и нерожавшие). В период адаптации и последующих экспериментов животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26 о С, относительная влажность 40–75%, 12-часовой световой день. Кормление мышей проводили в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Определение биохимических показателей для всех животных проводили в равных условиях с применением принятых в испытательном центре аналитических методов. В сыворотке крови мышей определяли следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Данные, представленные в статье, указывают на необходимость периодического пересмотра референсных интервалов у лабораторных животных, используемых в экспериментах. Кроме того, результаты, полученные в ходе исследования, подтверждают необходимость создания в каждом специализированном испытательном центре внутрилабораторных референсных интервалов не только для мышей, но и для каждого вида животных, применяемых в доклинических экспериментах, для более точной и детальной оценки клинического состояния исследуемых животных. Полученные референсные интервалы рассматриваемых показателей согласуются с аналогичными показателями из источников литературы, что косвенно свидетельствует об их надежности.

Введение

Этап доклинических исследований, направленный на оценку безопасности и изучение эффективности нового химического вещества [1, 2], является одним из наиболее важных при создании лекарственных средств. В связи с этим перспективность дальнейшего изучения свойств соединения будет зависеть от результатов, полученных на данном этапе исследования. В настоящее время остаются нерешенными важные вопросы, возникающие при проведении доклинической стадии изучения и требующие решения [3]. Одним из необходимых и определяющих этапов является подтверждение правильности использования методик измерения и интерпретации клинических лабораторных тестов, применяемых для изучения эффективности потенциального лекарственного агента на биоматериале от животных, а также периодическое обновление референсных интервалов биохимических показателей крови, мочи и т.д. Таким образом, выполнение данной процедуры – обязательный этап, отражающий качество работы клинической лаборатории и правильной интерпретации полученных результатов исследования [4].

Наиболее часто используемой тест-системой в доклинических исследованиях являются мыши [5]. Есть несколько моментов, связанных с этим аспектом: экономическая целесообразность – стоимость мышей относительно многих других лабораторных животных не требует больших денежных затрат, кроме того, их легко содержать. Они хорошо изучены, поэтому это сравнительно простая и понятная модель; эволюционно мышь близка к человеку, и ее эмбриональное развитие повторяет многие аспекты человеческого развития с точки зрения формирования структуры тела и активации генов [6]. Еще одним фактором является продолжительность жизни мыши – этот момент важен при оценке некоторых факторов, связанных с жизненным циклом в случае различных гериатрических исследований, с изменениями биохимических и иных показателей крови, мочи и др. Именно поэтому беспородных мышей и их биологический материал в настоящее время продолжают использовать в самых разнообразных исследованиях особенно в области токсикологии и фармакологии, направленных на изучение широкого диапазона свойств и активностей, таких как противоопухолевая [7], противодиабетическая [8], анксиолитическая [9], антидепрессивная [10] и др.

Важность и необходимость применения мышей в качестве тест-системы в доклинических исследованиях указывает на важность правильной интерпретации биохимических показателей крови животных, участвующих в эксперименте, которые указывают на нормальную работу внутренних органов и систем [6]. Для определения наличия либо отсутствия какого-либо патологического процесса (изменения биохимических показателей) у лабораторных животных необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов [11].

Цель работы – установить референсные интервалы у мышей – одной из самых востребованных тест-систем [6] для оценки основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и сделать анализ частоты статистических выбросов для этих показателей.

Материал и методы

Данные получены в АО НПО «Дом Фармации» в период с января 2018 г. по декабрь 2019 г. в ходе мониторинга здоровья животных. Использованы животные интактных групп, возраст самцов и самок аутбредных мышей составлял 2–3 мес, масса тела – 25,3±3,8 г. В проанализированном массиве находились данные от 100 самцов и 100 самок (небеременные и нерожавшие). В период адаптации и последующих экспериментов животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26 о С, относительная влажность 40–75%, 12-часовой световой день. Кормление мышей проводили в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Определение биохимических показателей для всех животных проводили в равных условиях с использованием общепринятых аналитических методов. В сыворотке крови животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (BioSystems, Испания) определяли следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин (ХС), триглицериды (ТГ), общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин (ОБ). Концентрацию ОБ определяли с помощью набора реактивов (Вектор-Бест, Россия), для определения уровня остальных аналитов использовали биохимические наборы (BioSystems, Испания). Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета программ Statistica10.0 (StatSoft, Россия), статистические выбросы оценивали с помощью метода Тьюки, вид распределения определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола проводили с применением U-критерия Манна –Уитни.

Результаты и обсуждение

Показатели, полученные в ходе мониторинга здоровья животных, были подвергнуты статистической обработке. Из общего массива данных были исключены статистические выбросы (СВ) для устранения аномальных значений, которые определяли отдельно для каждого рассмотренного показателя и пола по методу Тьюки. Были исключены данные, лежащие за пределами интервала Q3 и Q1 (1-го и 3-го квартилей). Межквартильный интервал IQR определяли как Q3–Q1. Верхний и нижний пределы рассчитывали следующим образом [2]:

Данные о доле статистических выбросов по каждому показателю и выходящих за пределы референсных интервалов (РИ) представлены в табл. 1. Наиболее частые СВ при анализе сыворотки крови мышей отмечали в отношении ОБ (4,9%) и АСТ (1,9%) у самок, а также ХС (1,9%) у самцов.

Референсные интервалы для полу-ченных результатов в зависимости от вида их распределения рассчитывали следующим образом:

Х_ср.±1,96•SD – для нормального распределения;

2,5–97,5 процентили (‰) – для ненормального распределения (табл. 2).

Вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка. Дополнительно проводили сравнение между животными разного пола методами непараметрической статистики для ненормального распределения (U-критерий Манна–Уитни) и методами параметрической статистики для нормально распределенных данных (t-критерий Стьюдента).

В ходе исследования выявлено, что средняя концентрация креатинина в сыворотке крови самцов может достигать более высоких значений, чем у самок (р 31 Ед/л [13], т.е. наблюдается схожая тенденция между двумя организмами. При анализе уровня ХС установлено значимое повышение показателя в крови самок (р самок (р повышение ТГ у мужчин относительно женщин также может наблюдаться после 20-летнего возраста – 0,55–3,21 и 0,43–1,21 ммоль/л соответственно [13, 14]. Установлено, что концентрация ОБ в сыворотке самцов значимо выше относительно самок (р мужчин превышает его количество у женщин. При рассмотрении полученных показателей мочевины, ЩФ, общего белка, альбумина и глюкозы статистической разницы не зарегистрировано.

Выявленные данные указывают на схожесть двух биологических систем (мышь и человек) по некоторым биохимическим показателям, что еще раз подтверждает важность и необходимость правильной работы клинической лаборатории в доклинических экспериментах, а также периодического пересмотра референсных интервалов используемых животных.

При анализе данных литературы, направленных на изучение биохимических показателей мышей (табл. 3), и сопоставление их с полученными значениями настоящего исследовании показало, что рассчитанные диапазоны РИ сопоставимы с аналогичными, указанными в литературе, но присутствуют и расхождения. Так, уровень АСТ у самок превышает аналогичный публикационный пример – 46–79 Ед/л [15, 17]. Референсный интервал ЩФ шире представленных значений в литературе – 51–134 Ед/л [15]. Стоит отметить, что данные отличия могут быть обусловлены множеством различных независимых друг от друга факторов – возрастными особенностями, условиями содержания, стрессоустойчивостью отдельно взятого животного, индивидуальными особенностями, сезонностью исследования, аналитическими методами. По результатам сравнения РИ, полученных в исследовании, с показателем источников литературы [6, 11, 15–17] можно сделать вывод о сопоставимости данных, что косвенно свидетельствует об их степени достоверности.

Значения, полученные в ходе исследования, подтверждают необходимость создания в каждом специализированном испытательном центре внутрилабораторных баз данных РИ не только для мышей, но и для каждого вида животных, применяемых в доклинических экспериментах, для более точной и детальной оценки клинического состояния исследуемых животных.

Известно, что в состоянии здоровья полученные результаты исследования нестатичны и непостоянны, испытывают колебания, амплитуда и ритм которых отражают его связь с некоторыми физиологическими процессами, называемыми внутрииндивидуальной биологической вариацией (CVi). В популяции индивидуальные амплитуды вариации могут не совпадать, отражая различия между здоровыми индивидуумами. Поэтому суммарные пределы вариации аналита для данной популяции –межиндивидуальная вариация (CVg) – всегда шире пределов внутрииндивидуальной вариации. Для каждого исследуемого показателя были рассчитаны коэффициенты вариации (CV=SD/Хср.•100%), что в грубом приближении соответствует межиндивидуальной вариабельности (CVg) этих показателей в человеческой популяции. Сравнительные данные по 2 видам приведены в табл. 4.

При анализе полученных данных можно отметить сходную с человеком вариабельность по большинству исследованных показателей. Так, полученные значения межиндивидуальной вариации ЩФ, мочевины, АСТ, АЛТ, ХС и ОБ мышей сопоставимы с таковыми человека. Однако в то же время показатели CVg креатинина, глюкозы, альбумина и общего белка мышей более чем в 2 раза превышают значения для человека, а уровень триглицеридов на треть меньше. Полученная картина может быть связана как с видовыми особенностями, так и с методами измерения, что свидетельствует о целесообразности обязательного установления и планового пересмотра референсных интервалов.

Заключение

Данные, представленные в статье, указывают на необходимость периодического пересмотра референсных интервалов лабораторных животных, используемых в экспериментах, а также подтверждают важность качественной оценки лабораторной диагностики доклинического этапа исследований. Полученные референсные интервалы рассматриваемых показателей коррелируют и соотносятся с аналогичными показателями из источников литературы, что подтверждает их достоверность. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови мышей и человека демонстрирует наличие видовых различий особенно для показателей, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Мирошников М.В. – сбор и систематизация материала, статистическая обработка данных, анализ и интерпретация результатов, написание, редактирование текста.
Макарова М.Н. – идея, согласование окончательной версии статьи.

Источник