Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: крысы
Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии,
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор,
А.А. Зуева, токсиколог
АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»,
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245
Резюме
Установление корректных референсных интервалов для лабораторных показателей актуально как в клинической практике, так и при проведении исследований на животных. Проведен ретроспективный анализ данных по 11 биохимическим показателям сыворотки крови крыс на большой выборке животных (196 самцов и 184 самки крыс, в возрасте 12–20 нед, массой 250–350 г).
Установлено, что в крови крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), выбросы других показателей, существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при планировании исследований, что требует увеличения числа повторностей при проведении анализа показателей.
Установлены референсные интервалы для креатинина, мочевины, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глюкозы и общего билирубина. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (более 30%) установлена для таких показателей, как активность щелочной фосфатазы, уровень триглицеридов, глюкозы и общего билирубина.
Проведено сравнение полученных в ходе ретроспективного анализа данных с референсными интервалами биохимических показателей крови крыс различных линий из 3 крупных питомников (Charles River, Taconic и Envigo). Представленные в литературе референсные интервалы также свидетельствуют о высокой вариабельности активности ряда ферментов (в том числе щелочной фосфатазы), а также концентрации глюкозы, общего билирубина и триглицеридов в крови крыс. Рассчитанные нами референсные интервалы хорошо сопоставимы с данными, представленными в литературе.
Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительном использовании именно ретроспективного анализа данных, который позволяет получить более корректные референсные интервалы на большей выборке животных, без ущерба для этических принципов. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови крыс и человека демонстрирует наличие видовых различий, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.
Введение
Биохимический анализ крови – неотъемлемая часть доклинических исследований, проводимых на лабораторных животных. В большинстве случаев дизайн эксперимента предусматривает сравнение показателей животных из интактных и подопытных групп. Число животных в группе, как правило, не превышает 10, что, с точки зрения статистики, является малой выборкой [1]. Для заключения о наличии/отсутствии клинической значимости наблюдаемых отклонений необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов (РИ).
В клинической практике применяют несколько способов установления РИ. Классический подход – формирование референсной группы с применением строгих правил включения и исключения, обследование и последующий расчет РИ. Это является трудоемким и дорогостоящим процессом для медицинских учреждений, а в доклинических исследованиях еще и противоречит нормам биоэтики, так как для установления РИ в каждой половой или возрастной группе требуется не менее 120 наблюдений [2, 4]. Другой подход – апостериорный (ретроспективный) – позволяет использовать для расчета РИ результаты, ранее полученные в данной лаборатории, за определенный период времени. Также на практике прибегают к данным в справочной литературе, что в доклинических исследованиях оправдано при анализе новых или редко используемых показателей или экзотических видов лабораторных животных.
В связи с изложенным, цель нашей работы – установление референсных интервалов для основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и оценка частоты статистических выбросов для этих показателей. Для установления РИ был выбран ретроспективный метод, что позволило включить в массив данных большое число животных, не нарушая при этом биоэтические принципы. Крысы являются одним из самых востребованных тест-систем. Поэтому мы рассматриваем вопрос установления РИ биохимических показателей на примере этих животных.
Материал и методы
Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в период проведения текущих исследований с октября 2018 по октябрь 2019 г. В массив данных включали животных интактных групп из 26 исследований, возраст самцов и самок аутбредных крыс составлял 12–20 нед, масса тела – 250–350 г (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). В сформированном массиве находились данные, полученные ранее от 196 самцов и 184 самок крыс. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Испания) были рассчитаны следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов Вектор-Бест (Россия), остальные аналиты – с помощью наборов Bio Systems (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна Уитни и t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5•IQR)-(Q3+1,5•IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.
После исключения выбросов массивы данных были проанализированы на соответствие действующим в центре РИ. Последние были рассчитаны с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (20 голов – 10 самцов и 10 самок). Данные о доле статистических выбросов, в том числе «extremes», по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.
Доли статистических выбросов и отклонений от действующих РИ
Источник
Нормы крови у крысы
В медицинской биотехнологии постановка экспериментов при помощи моделирования патологических состояний, например ожогового повреждения кожи, имеет огромное значение для глубокого исследования крови и кроветворных органов [3]. Исходя из этого, необходимо тщательное и всестороннее изучение всех изменений, которые происходят в организме при этих воздействиях. Главным образом это относится к системам поддержания гомеостаза [2].
Ожоговые поражения кожи стали в современном мире одним из наиболее социально значимых и распространенных типов травматических повреждений у человека. Изучению вопроса реакции клеток крови на ожоги посвящен ряд исследований [1, 8].
Любое заболевание, патологический процесс, а также ряд физиологических сдвигов могут в той или иной степени отразиться на количественных и качественных особенностях состава циркулирующей крови [5]. Этим и определяется огромное значение необходимости изучения крови. Белые клетки крови, имея высокую реактивность, быстро включаются в адаптационные реакции. Они способны к неспецифическому реагированию в ответ на альтерирующие воздействия.
Термическая травма сопровождается развитием интоксикации. Кровь в первую очередь подвергается действию токсических веществ, возникших в очаге поражения [1].
Свой вклад в общее состояние системы организма вносят компоненты крови. Наиболее уязвимым объектом для действия продуктов свободнорадикального окисления липидов является стенка кровеносных сосудов, что обусловлено высоким уровнем кислорода в крови и низким уровнем его утилизации [9]. В условиях патологического процесса происходит поражение неклеточного компонента сосудистой стенки.
Цель исследования – изучение показателей периферической крови половозрелых крыс в норме и в условиях термического воздействия.
Материалы и методы. Объектом исследования явились 50 беспородных крыс-самцов 4-месячного возраста. Во время эксперимента регистрировали общее состояние и поведение животных. Самцы крыс были разделены на пять групп по типу воздействия:
I группа – животные, не подвергшиеся ожоговому воздействию (контрольная, 10 шт.);
II группа – животные, получившие ожоговое воздействие и не подвергшиеся терапии (10 шт.). Раны регенерировали естественным путем;
III группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии спреем «Д-Пантенол» (10 шт.);
IV группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии бальзамом мазевой формы «Спасатель» (10 шт.);
V группа – животные, получившие ожоговое воздействие и подвергшиеся терапии аппликациями настойки календулы (10 шт.).
Исследование морфологических и биохимических показателей периферической крови заключалось в определении количества лейкоцитов, количества эритроцитов, лейкоцитарной формулы, уровня гемоглобина, перекисной резистентности эритроцитов.
Уровень гемоглобина в образцах крови крыс определяли электрофотометрическим способом на гемоглобинометре APEL Hemoglobinmeter HG-202. Мазки фиксировали и окрашивали по Романовскому – Гимзе. Идентификация форменных элементов крови проводилась согласно методике Н. Т. Ивановой [4]. Количество эритроцитов крови подсчитывали по стандартной методике в камере Горяева. Количество лейкоцитов считали по мазкам крови крыс.
Для оценки уровня свободнорадикального окисления и выраженности в связи с этим липолитических процессов в крови проводили измерение перекисной резистентности эритроцитов. Перекисный гемолиз эритроцитов является чувствительным показателем, отражающим про– и антиоксидантный баланс организма [6].
Для определения перекисного гемолиза эритроцитов использовали модификацию методов определения степени перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) А. А. Покровского и А. А. Абразцова [7], которую предложили А. Е. Лазько, Р. И. Асфандияров и А. А. Резаев [4].
Результаты исследования и их обсуждение. Анализ гематологических исследований экспериментальных животных показал, что наиболее высокий уровень гемоглобина периферической крови наблюдался у крыс, лечившихся бальзамом «Спасатель» и спреем «Д-пантенол», что наглядно отображено в таблице 1. В группе крыс, лечившихся настойкой календулы, данный показатель незначительно отличался от значений у обожженных животных, не получавших лечения.
Гематологические показатели через 3 суток после ожоговой травмы
Источник
Нормы крови у крысы
Загрязнение воздушного бассейна города Алматы выбросами выхлопных газов из двигателей внутреннего сгорания приобретает угрожающие размеры, особенно, если учесть тот факт, что город практически мало продувается ветрами. Количество автомобильного транспорта, в особенности частного, растет очень быстрыми темпами. Известно, что выхлопные газы автомобилей содержат очень большое количество ядовитых и вредных веществ, включая органические соединения и соединения тяжелых металлов, в том числе кадмия. Кадмий вызывает повреждение почечных канальцев. Одним из характерных признаков влияния Cd на организм человека и животных являются также нарушения в костной системе, в том числе остеомаляция. Было обнаружено, что содержание Cd и Pb в зубах и костях зависит от их уровня в окружающей среде. Существует мнение, что хотя степень остеомаляции у взрослых и связана с количеством токсиканта в организме, однако, она состоит не в прямом влиянии металлов на костную систему, а опосредуется нарушениями гомеостаза, вызванными повреждением почек, в которых происходит накопление металлотионеинов. Эти металлопротеиновые комплексы, образующиеся для инактивации токсичных металлов, сами обладают повреждающей способностью 1. Имеются сведения о том, что Cd обладает ингибирующим влиянием на рост клеток периодонтальной связки зубов, путём воздействия на метаболизм в организме [4], что могло бы, в свою очередь, повлиять на состояние дёсен.
Имея в виду вышеупомянутую опосредованность нарушений в состоянии дёсен, от гомеостаза, нас заинтересовало функциональное состояние почек при воздействии хлористого кадмия. Одним из признаков повреждения почек является увеличение количества креатинина [5]. Важным информативным признаком изменения деятельности почек служит и мочевина крови, в основном выводимой из организма почками [6].
Учитывая важность разностороннего изучения способов противодействия влиянию вредных факторов окружающей среды на организм животных и человека, проводятся исследования с использованием различных препаратов, обладающих протекторными свойствами, как например, энтеросорбентов. Использование энтеросорбентов- ионообменников, (таких как монтмориллонит Тагансорбент), имеющих в своём составе гидроокиси и карбонаты Са, Мg и других металлов, должно оказать протекторное влияние на поступления кадмия в организм.
Целью настоящего исследования была оценка влияния применения Тагансорбента на содержание мочевины и креатинина в крови крыс, при затравке хлористым кадмием в дозе 1,5 мг/кг для установления функционального состояния почек этих животных.
Опыты проводились на белых беспородных крысах – самцах весом 238,50 ± 29,6 г. Хлористый кадмий давался животным ежедневно с кормом (по 1,5 мг/кг) в течение 2,5 месяцев. Затем этих животных поделили на 2 группы. Первая группа получала Тагансорбент (по 1,0 г/кг веса ежедневно, в течение месяца в составе стандартного корма). Вторая группа в течение месяца получала стандартный виварный рацион. Затем, на 1, 7, 14, 21 сутки после окончания дачи сорбента, забиралось по 2-3 крысы из каждой группы для проведения острых экспериментов (наркоз – ингаляция эфира). Контролем служили интактные крысы. У животных производился забор проб крови из брюшной аорты. В пробах исследовалось содержание мочевины и креатинина. Всего было проведено 45 опытов на 46 животных (включавших 86 биохимических анализов). Материал был обработан статистически, с использованием компьютерного пакета STATISTICA. Данные считались достоверными при Р
Источник
Нормы крови у крысы
Главным приоритетом концепции развития хлебопекарной отрасли до 2020 г. «Хлеб – это здоровье» является содействие улучшению здоровья и качества жизни населения посредством создания условий увеличения потребления высококачественных безопасных хлебобулочных изделий функционального и специализированного назначения.
В настоящее время неправильное питание стало проблемой человечества. Быстрые перекусы, употребление некачественной пищи, фастфуда, переедание вызывают развитие болезней желудочно-кишечного тракта, способствуют засорению кровеносных сосудов и приводят к дисбалансу минеральных веществ, витаминов, пищевых волокон и других незаменимых нутриентов. В связи с этим основная задача хлебопекарной отрасли – это разработка изделий функционального назначения, в том числе для лиц, страдающих почечной недостаточностью и сердечно-сосудистыми заболеваниями.
В Воронежском государственном университете инженерных технологий на кафедре технологии хлебопекарного, кондитерского, макаронного и зерноперерабатывающего производств разработана рецептура ахлоридного хлеба «Завет» с внесением муки из цельносмолотого зерна пшеницы и отрубей гречишных.
Целью исследований было определение влияния ахлоридного хлеба на организм крыс и описание биохимических, общих клинических показателей крови и патологических изменений в органах животных.
Перевариваемость и усвояемость хлеба определяли методом in vivo на половозрелых крысах. Было сформировано 2 группы по 5 животных, одной из которых (опытной) в течение 30 дней в рацион вводили хлеб из смеси муки из цельносмолотого зерна пшеницы и пшеничной первого сорта с внесением обогатителей: муки из отрубей гречишных и сывороточного напитка «Актуаль», второй группе (контрольной) – хлеб белый из пшеничной муки первого сорта, приготовленный по рецептуре, указанной в сборнике технологических инструкций [2].
В течение всего периода опыта вели наблюдение за грызунами: учитывали поедаемость корма, прием воды, поведенческий и клинический статус, животных взвешивали перед началом эксперимента и после окончания. В период опыта не отмечено изменений поведенческого и клинического статуса.
Результаты исследований биохимических показателей крови представлены в табл. 1.
Биохимические показатели крови крыс
Значения показателей в группах
Общий белок крови характеризует обменные процессы в организме и функции печени, так как большинство из них синтезируется именно в этом органе. Снижение общего белка в крови приводит к голоданию, заболеванию почек, кровопотерям, сахарному диабету, заболеваниям печени, отравлением токсическими веществами. Завышение этого показателя может стать причиной обезвоживания организма и других серьезных нарушений. Биохимический анализ крови крыс показал, что общий белок находится в пределах нормы и у животных отсутствуют вышеперечисленные патологии.
Более половины энергии, которую расходует организм, образуется за счет окисления глюкозы, основного показателя углеводного обмена. При физических нагрузках уровень глюкозы в организме несколько повышается для обеспечения мышц необходимой энергией [1].
У опытной группы крыс наблюдается понижение глюкозы на 21,5 %, что указывает на интенсивный обмен веществ за счет большего содержания в хлебе пищевых волокон и лучшего обеспечения организма энергией [3].
Важным признаком изменения деятельности почек служит мочевина крови, в основном выводимая из организма почками. Содержание мочевины в крови – это косвенный показатель функции почек, так как именно это вещество выводится с мочой в качестве конечного продукта обмена белков. Результат показывает отсутствие нарушений работы органа [6]. Согласно полученным данным содержание мочевины у крыс находится в норме, что соответствует правильной работе почек и отсутствию патологий.
Одними из ключевых ферментов азотистого обмена являются аминотрансферазы. Фермент аспартатаминотрансфераза (АсАТ) необходим для нормального функционирования мышечной ткани, а аланинаминотрансфераза (АлАТ) выделяется в крови при поражении печеночной ткани. Если присутствуют заболевания, приводящие к повреждению клеток, которые насыщены АлАТ, происходит выброс в кровь аланинаминотрасферазы, т.е. АлАТ повышен. Повышение этих показателей свидетельствует о патологических изменениях в организме и необходимости медикаментозного лечения. Ферменты АсАТ и АлАТ, содержащиеся в пробах крови животных, соответствуют норме.
Креатинин – вещество, участвующее в системном энергообмене мышечных волокон. Одним из признаков повреждения почек является увеличение количества креатинина. О накоплении в организме токсичных веществ в крови крыс можно судить по показателю мочевины и креатинина [6]. У опытной группы животных наблюдалось снижение показателя в пределах нормы по сравнению с контролем.
Билирубин – показатель, характеризующий функцию печени и степень распада эритроцитов. Это вещество является конечным продуктом распада гемоглобина. Этот процесс происходит в печени, затем с желчью продукты распада выводятся из кишечника. У испытуемых животных показатель билирубина находится в норме, что свидетельствует о правильной работе печени.
Холестерин – жироподобное вещество животного происхождения. Холестерин в крови переносится липопротеидами – сложными белками (протеинами), в состав которых входят жиры (липиды). Липротеиды высокой плотности (ЛВП) переносят около 20 % холестерина. Они состоят главным образом, из лецитина, благодаря действию которого холестерин может легко транспортироваться по крови, не засоряя артерии. Чем выше уровень ЛВП, тем лучше. Липопротеиды низкой плотности (ЛНП) переносят 65 % холестерина и способны забить артерии [4].
Известно, что холестерин является важным источником клеточных биомембран животных и человека. Выполняя структурную и функциональную роль, он влияет на клеточное деление, активность белковых рецепторов плазматических мембран и мембрансвязанных ферментов, стабильность сывороточных липопротеидов и транспортных структур желчи [5]. У опытной группы животных наблюдалось снижение холестерина в пределах нормы, что указывает на нормальную работу сердечно-сосудистой системы и отсутствие засорения артерий липопротеидами низкой плотности.
Кровь, кроме плазмы, включает форменные элементы: эритроциты (осуществляют транспорт кислорода), лейкоциты (формируют иммунную систему) и тромбоциты (обеспечивают свертываемость крови). Показатели лейкоцитов в общем анализе крови позволяют оценить состояние иммунитета и даже определить причину заболевания. Превышение уровня лейкоцитов характеризует острые бактериальные инфекции, гнойные воспаления. При падении лейкоцитов ниже уровня нормы вероятна вирусная инфекция [3]. Показатели лейкоцитов у обеих групп крыс находятся в норме. Это констатирует отсутствие инфекционных заболеваний (табл. 2).
Результаты общего клинического анализа крови крыс
Источник