Методические подходы к оценке паралитического синдрома токсического генеза в экспериментах на грызунах
Н.С. Ильинский, заместитель начальника отдела ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ. ORCID: 0000-0001-7406-753X
М.А. Тюнин, начальник отдела ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ, к.м.н., ORCID: 0000-0002-6974-5583
М.О. Матросова, младший научный сотрудник ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ. ORCID: 0000-0002-1395-823X
ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» Министерства обороны Российской Федерации
195043, Санкт-Петербург, ул. Лесопарковая, д. 4
Резюме
Требования фармакологической безопасности предписывают необходимость выполнения экспериментальной оценки потенциальных нейротоксичных эффектов разрабатываемых лекарственных средств. При этом сохранена необходимость экспериментального моделирования заболеваний периферической нервной системы для изучения их патогенеза и разработки новых подходов к терапии. В настоящее время внедрен в практику широкий перечень клинико-функциональных тестов, позволяющих выявить многие виды неврологического дефицита. Однако сохраняются некоторые терминологические и методологические разночтения между клинической и экспериментальной практикой. Все это обусловливает высокую актуальность исследований по совершенствованию методов оценки нейротоксических эффектов ксенобиотиков в экспериментах на лабораторных грызунах.
Цель – сравнить информативность исследования физиологического двигательного рефлекса у крыс при помощи шкалы отведения пальцев с другими рекомендованными методиками оценки периферического пареза.
Проведено комплексное клинико-инструментальное исследование по динамической оценке неврологического статуса самцов беспородных крыс на модели токсического тетрапареза, вызванного подкожным введением ЛД16 тетродотоксина. Введение тетродотоксина способно стабильно и с высокой повторяемостью вызывать у подопытных животных своеобразный синдром моторного дефицита (периферический парез) за счет неврального и мышечного компонентов. Внешние проявления интоксикации у крыс оценивали с помощью теста подтягивания на перекладине, «Ротарод» и шкалы отведения пальцев. С целью верификации нарушений процессов неврального проведения и нервно-мышечной передачи животным выполняли электронейромиографию и декремент-тест.
Результаты исследования продемонстрировали, что общепринятый в настоящее время методический аппарат экспериментальной оценки неврологического статуса способен выявить нарушения двигательных функций у крыс при достаточной их выраженности, когда по данным нейрофизиологического исследования уже наличествуют грубые изменения основных параметров. В ходе сравнения скорости возникновения и выраженности внешних признаков интоксикации установлено, что оценка физиологического двигательного рефлекса при помощи шкалы отведения пальцев обладает достаточно высокой информативностью и простотой тестирования, делая возможным выявление ранних признаков периферического пареза токсического генеза.
Введение
Вопросы стандартизации и повышения качества исследований безопасности химических соединений, особенно в отношении нейротоксичности, в экспериментах на животных представляют актуальную задачу, в том числе по причине методических разночтений. На сегодняшний день сохранена проблема неоднозначных подходов к терминологии, способам оценки и трактовке результатов исследований параличей (парезов) токсического генеза, при этом их скрининговая доклиническая оценка на грызунах представляет собой необходимый минимум, что подтверждено наличием многочисленных вариаций батарей клинико-функциональных тестов (КФТ) [1]. В соответствии с принятой в неврологии терминологией [2] расстройство двигательной функции в виде полного отсутствия произвольных движений вследствие нарушения иннервации соответствующих мышц называют параличом. При частичном нарушении двигательной функции говорят о парезе. Для периферических параличей (парезов) характерно сочетание следующих признаков: снижение объема активных движений и/или мышечной силы; снижение мышечного тонуса, физиологических рефлексов, замыкающихся на этих мышцах; атрофия или гипотрофия паретичных мышц; фасцикуляции (или фибрилляции) пораженных мышц [2]. Следовательно, для одновременной оценки всех вышеописанных симптомов необходимо применять комплекс соответствующих диагностических приемов. Методический аппарат по исследованию мышечной силы у мелких лабораторных животных наиболее разнообразен и популярен среди иностранных и отечественных ученых. Широко применяют методики подтягивания на горизонтальной перекладине, удерживания на решетке, измерение силы захвата с использованием специализированных приборов [1]. Несколько несоответствующими цели, однако, общепринятыми и традиционными способами оценки состояния мышечного тонуса (или миорелаксантного эффекта) в экспериментах являются методы вращающегося стержня («Ротарод»), бега на третбане, ипсилатеральный сгибательный рефлекс. Наиболее близкая к клинической практике методика пальпаторного исследования тонуса мышц живота у крыс выглядит излишне субъективной и трудно ранжируемой [2].
Вместе с тем в отечественной литературе представлено недостаточно методик исследования состояния двигательных рефлексов у грызунов как признаков периферического пареза. В связи с этим проведено сравнительное динамическое исследование информативности различных способов оценки двигательных функций крыс в эксперименте на модели острого тяжелого отравления блокатором натриевых каналов. Выбор тетродотоксина (ТТ) в качестве модельного токсиканта обусловлен особенностями его механизма действия, определяемыми наличием точек приложения на протяжении аксонов смешанных периферических нервов и на сарколемме поперечнополосатых миоцитов, что позволяет в течение короткого времени стабильно и с высокой повторяемостью вызывать у подопытных животных своеобразный синдром моторного дефицита (периферический парез) за счет неврального и мышечного компонентов.
Цель исследования – сравнить информативность исследования физиологического двигательного рефлекса у крыс при помощи шкалы отведения пальцев (ШОП) с другими рекомендованными методиками оценки периферического пареза.
Материал и методы
Эксперименты выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики и директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.
Исследование проведено на 40 самцах беспородных крыс (питомник ФГУП «ПЛЖ «Рапполово», Ленинградская обл., Россия). Животных содержали в стандартных условиях окружающей среды (фоторежим 12 ч свет/12 ч темнота, температура воздуха 22±3°С, влажность 55±10%). В качестве корма использовали «Корм для содержания лабораторных животных» ЛБК-120, приготовленный в соответствии с ГОСТом Р 50258-92. Воду в стандартных поилках со стальными крышками-носиками давали ad libitum. В качестве подстила использовали древесные опилки из лиственных пород деревьев. После завершения эксперимента животных подвергали эвтаназии в СО2-камере.
Периферический парез токсической природы моделировали путем подкожного введения раствора ТТ (CAS № 4368-28-9, Sigma Aldrich, Германия) в дозе ЛД16 (8,5 мкг/кг). В качестве растворителя использовали цитратный буфер (рН 4,5). Исследования выполняли в двух равных группах животных. Весь объем обследования животных проводили с периодичностью в 2 мин в течение первых 30 мин после введения ТТ.
Первую группу (n=20) оценивали с помощью КФТ (ШОП, «Ротарод», ООО «Нейроботикс», Россия), подтягивание на горизонтальной перекладине). Оценку по ШОП выполняли в соответствии с методикой R.S. Broide и соавт. [3] в собственной модификации. Оценивали выраженность рефлекторного разведения пальцев стоп при поднятии крысы за хвост на высоту 20 см над поверхностью и имитации падения. В норме крыса готовится к приземлению и широко расставляет грудные и тазовые конечности, разводя при этом пальцы. Здоровое животное способно удерживать такое положение достаточно длительно (>10 с), что соответствовало 0 баллов ШОП. На фоне токсического пареза выраженность данного рефлекса снижалась: первоначально крыса расставляла пальцы на несколько секунд, затем 1 или 2 пальца стопы оказывались прижатыми друг к другу – 1 балл, 3 пальца – 2 балла, 4 пальца – 3 балла, все 5 пальцев или полное отсутствие попытки разведения пальцев – 4 балла. Методику «Ротарод» (ООО «Нейроботикс», Россия) выполняли, измеряя время (с), в течение которого крыса способна передвигаться по вращающемуся со скоростью 5 об/мин стержню (в норме >120 с) [1]. Тест подтягивания на горизонтальной перекладине («перекладина») оценивали по способности крыс подтянуться из положения виса на передних конечностях и зацепиться нижней конечностью за перекладину в течение 20 с. Тест считался не выполненным (отрицательным), если животному требовалось больше времени или оно вовсе не удерживалось на перекладине [1].
С целью объективизации нарушений нервно-мышечного проведения и передачи второй группе крыс (n=20) выполняли электронейромиографию (ЭНМГ) икроножной мышцы (n. tibialis) правой тазовой конечности по методике, описанной ранее [4]. При одиночной стимуляции оценивали следующие параметры М-ответа: амплитуда, длительность, площадь, дистальная латентность. При ритмической стимуляции фиксировали характер и степень выраженности декремента площади М-ответов. Сравнение показателей проводили с данными, полученными заблаговременно до индукции отравления (фоновые значения). ЭНМГ-феномены количественно характеризовали степень снижения амплитуды последнего М-ответа относительно первого. При выявлении инкремента выполняли анализ по площади негативного пика для исключения псевдофасилитации. Колебания площади М-ответов в пределах 10% принимали за норму.
Связанные выборки сравнивали с помощью непараметрического критерия знаковых рангов Уилкоксона; бинарные данные определяли, используя точный критерий Фишера. Результаты представляли в виде медианы и межквартильного интервала. Для статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0 (StatSoft, США) в операционной среде Windows 7. За номинальный уровень статистической значимости принимали значение р течение следующих 10 мин наблюдения.
ЭНМГ-исследование позволило выявить ТТ-индуцированное страдание функций периферической нервной системы в виде статистически значимых изменений основных параметров неврального проведения раньше, чем любой из КФТ. Так, длительность М-ответов увеличилась (р=0,04) уже через 6 мин после введения ТТ, амплитуда уменьшилась (р=0,01) через 10 мин, латентность увеличилась (р=0,03) через 15 мин. Нарастание декремента площади М-ответов как признак снижения надежности нервно-мышечной передачи достигло уровня статистической значимости через 8 мин.
Заключение
Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что общепринятый в настоящее время методический аппарат экспериментальной оценки паралитического или миорелаксантного действия ксенобиотиков с помощью КФТ способен выявить нарушения нервно-мышечного проведения и передачи при достаточной их выраженности, когда по данным ЭНМГ уже наличествуют грубые изменения основных параметров. При этом рассмотренная адаптированная методика ШОП позволила обнаружить наиболее ранние признаки периферического пареза, что было хронологически сопоставимо с данными ЭНМГ. Оценка физиологического двигательного рефлекса у крыс при помощи ШОП обладает достаточно высокой информативностью и простотой тестирования, делая возможным выявление ранних признаков периферического пареза на фоне отравления ТТ. С целью дальнейшей валидации искомой методики целесообразно проводить эксперименты с применением нейротоксичных ксенобиотиков других химических групп и механизмов действия, а также изучить зависимость баллов по ШОП с дозами выбранных токсикантов.
Вклад авторов
Н.С. Ильинский – концепция, сбор и анализ данных, написание текста статьи.
М.А. Тюнин – научное консультирование, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.
М.О. Матросова – сбор и анализ данных.
Источник
Подбор тестов для оценки нейропсихического состояния крыс при ишемии головного мозга
Г.А. Морозова, Н.А. Малиновская, А.Б. Салмина, М.М. Петрова, С.В. Прокопенко, Ю.К. Комлева, Ю.А. Панина
Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии,
г. Красноярск
Цель исследования: Выбор оптимального набора тестов для оценки нейропсихических функций крыс в экспериментальных моделях глобальной и фокальной ишемии головного мозга.
Материалы и методы: Объект исследования – крысы-самцы Wistar c массой 180-200 г в количестве 50 (все животные, кроме крыс с 1-сторонней перевязкой) и белые беспородные самцы крыс массой 180-200 г в количестве 20 (животные с 1-сторонней перевязкой).Экспериментальная модель острой фокальной ишемии головного мозга (n=20) осуществлялась анестезированным животным путем экстравазальной окклюзии правой общей сонной артерии (ОСА), а модель острой глобальной ишемии (n=20) — путем экстравазальной билатеральной окклюзии обеих ОСА с последующей оценкой всех тестируемых параметров через 24 и 48 часов после выполнения операций. Контролями явились ложно-оперированные животные (sham-операция, n=20) с последующей оценкой всех тестируемых параметров в те же сроки после выполнения ложной операции и интактные животные (n=10). Анализ неврологического статуса крыс проводился с помощью NSS-теста, когнитивной дисфункции – с использованием водного лабиринта Морриса. Оценка сенсорной дисфункции крыс в моделях ишемии осуществлялась с использованием «вибриссового» теста, моторная дисфункция задних лап оценивалась в тесте «сужающаяся дорожка», передних лап – в «адгезивном» тесте. Статистический анализ проводили с помощью теста Манна-Уитни.
Результаты: Результаты применения тестов для оценки состояния крыс приведены в Таблице. Для оценки нейропсихических функций при фокальной ишемии головного мозга высокая значимость отмечена при использовании NSS-теста для оценки моторной, сенсорной сфер, оценки рефлексов и равновесия. При глобальной ишемии головного мозга NSS-тест не показателен, так как у животных в тяжелом состоянии проведение этого теста невозможно ввиду крайне тяжелого состояния и смертности в 50 % случаев. Применение водного лабиринта Морриса нецелесообразно при фокальной ишемии головного мозга, при которой когнитивная дисфункция не развивается. При глобальной ишемии головного мозга применение водного лабиринта Морриса показало свою значимость.
Нейропсихическое состояние крыс при ишемии головного мозга
Источник
Оценка неврологического статуса у крыс
Рассеянный склероз — хроническое заболевание центральной нервной системы, которое является наиболее распространенным хроническим неврологическим расстройством у молодых людей [1]. В основе его патологии лежит воспалительный процесс, сопровождающийся демиелинизацией. Уже на ранних стадиях заболевания у пациентов с рассеянным склерозом (РС) наблюдается когнитивный дефицит. Для лечения больных с РС за последние три десятилетия использовали разные группы препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием [2; 3], что связано с тем, что наиболее важную роль в патогенезе рассеянного склероза отводят аутоиммунным механизмам. При этом данное заболевание сопровождается также нарушением центральной нейромедиации [4; 5], изменение которой не менее важно для определения прогрессирования заболевания. В том числе установлена роль глутамата и норадреналина в патогенезе рассеянного склероза, что было также подтверждено на модели экспериментальном аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ). Данная модель наиболее часто используется при изучении рассеянного склероза 8. В модели ЭАЭ было изучено влияние структурного аналога центрального вазодилататора винкамина виндебурнола на экспрессию тирозингидроксилазы, предшественника норадреналина, в Locus coeruleus. Было высказано предположение о том, что препараты, подобные виндебурнолу, активируя норадренергическую медиацию в Locus coeruleus, могут способствовать снижению симптоматики рассеянного склероза [9].
Целью данной работы явилось изучение влияния виндебурнола на гистологические показатели в мозге и неврологический статус крыс в модели экспериментального аллергического энцефаломиелита.
Эксперименты на животных выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). В эксперимент вошли 3-4-месячные самки беспородных крыс. Всех животных делили на 3 группы: 1 — контрольная группа (n=20); 2 — моделирование ЭАЭ (n=30); 3 — после моделирования ЭАЭ подкожно вводили виндебурнол в дозировке 20 мк/кг со дня первых проявлений неврологического дефицита в течение последующих 10 суток (до пика клинических проявлений заболевания). Расчет дозы виндебурнола производили путем вычисления LD50 для данного вида животных с границей доверительного интервала 95%. Материалом для иммунизации животных с целью воспроизведения ЭАЭ служил спинной мозг беспородных белых крыс без неврологической симптоматики с модифицированным полным адьювантом Фрейнда. Реакцию животных на введение препарата оценивали по уровню проявления неврологического дефицита и патоморфологических изменений в головном мозге крыс экспериментальных групп на пике острой фазы заболевания. Для оценки клинической тяжести заболевания использованы следующие стандартные показатели [10], в том числе общие (вес тела, летальность) и показатели неврологического дефицита:
1. Клинический индекс, который вычисляли в баллах по следующим показателям:
0 баллов – нет очевидных клинических проявлений; 1 балл – сниженный тонус хвоста; 2 балла – слабость и легкий паралич задних конечностей, переваливающаяся походка, медленное восстановление положения тела из положения на боку; 3 балла – тяжелый паралич задних конечностей или всех; 4 – тетраплегия (паралич четырех конечностей); 5 – агональное состояние; 6 – смерть.
2. Оценку неврологического дефицита также проводили с использованием метода [11]. Итоговый балл по данному методу формируется как сумма баллов в 3 двигательных тестах, определяющих мышечную силу, цепкость-тягу и равновесие, что позволяет оценить функциональное состояние экстрапирамидной системы. При этом 0 баллов свидетельствует о максимальной выраженности нарушений, а 9 баллов — об их отсутствии. Тяжесть неврологических нарушений фиксировали на видеокамеру.
Для гистологического исследования животных декапитировали под нембуталовым наркозом (35 мг/кг веса), ткань головного мозга животных фиксировали в 10%-ном нейтральном буферированном формалине, заливали в парафин, из тканевых блоков готовили срезы толщиной 6-8 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином. Окрашенные срезы исследовали под световым микроскопом с возможностью фоторегистрации. Секции мозга оценивали независимо для определения центров воспаления слепым методом, без информации о характере обработки животного до умерщвления. Образцы для каждого животного подготавливали идентичным образом и определяли степень воспалительной инфильтрации [12]. Обработку фотографий проводили с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health (NIH) http:/rsb.info.nih.gov/ij/).
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ Statistica 8.0.
На первом этапе исследования оценивали продолжительность латентного, клинического периодов, а также общее число заболевших и тяжело больных крыс (в % от числа крыс в группе), средний клинический индекс на пике заболевания и средний кумулятивный индекс болезни. Было иммунизировано 30 крыс, у 14 из которых выявлены были неврологические нарушения, т.е. развивался ЭАЭ. Процент выживаемости среди заболевших крыс составил 86%. Продолжительность латентного периода у заболевших животных в среднем составила 6,5 суток. В этот период животные не теряли массу. До иммунизации средний вес крыс составлял 248 г, к 7-м суткам после иммунизации вес заболевших животных незначительно снизился (до 227 г). С 8-х суток после иммунизации у заболевших крыс наблюдали достоверное снижение веса (р
Источник