Препарат клетка печени крысы
Ядрышко – это динамичная органелла клетки, и его структура отражает уровни трех основных процессов, связанных с биогенезом рибосом: синтез прерибосомальной рибонуклеиновой кислоты (преРНК), процессинг и миграцию рибонуклеопротеидных частиц в нуклеоплазму [1]. Одним из замечательных свойств ядрышек является их высокая пластичность, которая проявляется в изменении размеров, морфологии и локализации в ядре при реакции на многие внешние стрессовые воздействия, а также при адаптации к неблагоприятным факторам [2; 3]. По данным некоторых авторов, ядрышко можно рассматривать в качестве центральной фигуры, координирующей клеточный ответ на стрессовые воздействия [4]. Так, по данным Чучковой Н.Н. и соавт. (2016), экспериментальная алиментарная гиперхолестеринемия у крыс сопровождалась реактивной перестройкой нуклеолярного аппарата клеток печени (увеличивалось число мелких и плотных ядрышек), что свидетельствует о снижении синтетической активности гепатоцитов [5]. Солин А.В. и соавт. (2016) показали, что при адаптации к длительному стрессу, вызванному ограничением движения, в клетках печени крыс наблюдалось возрастание количества ядрышек [6]. Многие авторы также отмечали увеличение числа, площади ядрышек и ядрышко-ядерного соотношения при репаративной регенерации печени, в частности при экспериментальном циррозе и других патологиях [7; 8].
В литературе имеется небольшое количество работ, посвященных морфологии ядрышка клеток печени при гипотермии. Капрелянц А.С. и соавт. (1985) в гепатоцитах, подвергнутых гипотермии, отмечали перемещение ядрышка на периферию ядра, к его мембране, что данные авторы объясняют увеличением ядерно-цитоплазматических отношений и усилением регуляторного влияния ядра на цитоплазму [9]. По данным других авторов, под влиянием низкой температуры (2 часа при 0-4 °С) в печени крыс происходила дегрануляция ядрышек, а через 10 часов после помещения животных снова в нормальные температурные условия ультраструктура ядрышек восстанавливалась [10]. Молодых О.П. (2001) при электронной микроскопии в ядрышках клеток печени при холодовом стрессе отмечала явления сегрегации гранулярного и фибриллярного компонентов, которая отражает низкий уровень синтеза рибосомной РНК и, как следствие, низкий уровень метаболизма в целом [11]. Исследований ядрышковых организаторов клеток печени методом серебрения при воздействии холодом в литературе нами не обнаружено.
Целью исследования являлась оценка морфофункциональной активности ядрышковых организаторов гепатоцитов крысы при экспериментальном холодовом стрессе и в постгипотермическом периоде.
Материал и методы исследования
Исследование выполнено на 20 белых крысах линии Wistar. Гипотермию моделировали путем помещения животных, находящихся в индивидуальных клетках, в воду температурой 5 °С, при температуре окружающего воздуха 7 °С. Критерием прекращения эксперимента служило достижение животными ректальной температуры 20-25 °С, что соответствовало глубокой степени гипотермии. Время экспозиции было индивидуальным и в среднем составляло 40 ± 5 мин. В ходе эксперимента животные были разделены на 4 группы. Животные 1-й группы (n = 5) умерщвлялись сразу после прекращения охлаждения, животные 2-й группы (n = 5) выводились из эксперимента через 2 суток после прекращения охлаждения, печень животных 3-й группы (n = 5) исследовали через 5 суток после прекращения охлаждения, и животных 4-й группы (n = 5) изучали через 14 дней после прекращения воздействия гипотермии.
Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, и директивами -86/609/EEC [12]. Обезболивание и умерщвление животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, забуференном по Лилли. Проводку материала осуществляли по изопропиловому спирту с помощью автомата проводки карусельного типа TISSUE-TEK VIPTM6 (Sakkura, Япония), заливали в парафин при помощи станции парафиновой заливки TISSUE-TEK TEC 5 (Sakkura, Япония). Гистологические срезы толщиной 4-7 мкм получали с использованием полуавтоматического роторного микротома Accu-Cut SRM (Sakkura, Япония). Окрашивали срезы гематоксилином и эозином в автомате для автоматической окраски микропрепаратов TISSUE-TEK Prisma (Sakkura, Япония) и заключали препараты под пленку в автомате для автоматического заключения микропрепаратов TISSUE-TEK Film (Sakkura, Япония). На окрашенных гематоксилином и эозином гистологических препаратах высчитывали число гепатоцитов в 5 полях зрения при увеличении х400 и индекс альтерации (процент некротизированных гепатоцитов).
Выявление ядрышковых организаторов осуществляли по двухступенчатому методу Daskal Y. et al., в нашей модификации [13; 14]. При увеличении х1000 под масляной иммерсией микроскопа высчитывали число ядрышек, суммарную площадь аргирофильных гранул (AgNORs) на 1 ядро, площадь одного ядрышкового организатора и ядрышко-ядерное соотношение (Ядр/яд) в относительных единицах (отн. ед.). Морфометрические измерения проводили с помощью аппаратно-программного комплекса, состоящего из программного обеспечения для морфометрического анализа ВидеоТест-Морфология 5.2, цифровой камеры VIDI CAM (Россия), адаптированной к световому микроскопу Nikon Eclipse E200 (Япония), и персонального компьютера. У каждого животного исследовали не менее 25-30 ядер гепатоцитов.
Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. Если при проверке статистических гипотез распределение данных было нормальным, то применяли методы параметрической статистики (t-test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка W = 0,89, p
Источник
Препарат клетка печени крысы
Звездчатые клетки печени (жиронакапливающие клетки, липоциты печени, или клетки Ито), локализующиеся в пространствах Диссе и содержащие ретиноиды, привлекают внимание исследователей — гистологов, физиологов, гепатологов на протяжении более 130 лет, но лишь в последние годы, после значительного прогресса методов структурного исследования, появились доказательства их роли в фиброгенных процессах печени [1, 3, 4, 6, 7, 12, 14].
В настоящее время функции звездчатых клеток печени связывают не только с поражением печени, но и с развитием, регенерацией печени, реакцией на воздействия ксенобиотиков и иммунорегуляцией. Разрабатываются аспекты необходимого участия звездчатых клеток печени в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток печени [15]. Звездчатые клетки рассматриваются как необходимое звено в пространстве Диссе, участвующее в тонкой регуляции аутокринных и паракринных стимулов, в быстром ответе на изменения компонентов экстрацеллюлярного матрикса и адекватном реагировании на метаболические потребности, возникающие в онтогенезе. Более того, жизненно важная функция поддержания системного гомеостаза связана с депонированием и мобилизацией ретиноидов, их способностью презентации антигенов и индукции толерантности, так же как с определенными взаимоотношениями с потомками костномозговых клеток [9]. Интерес к этому типу клеток неуклонно возрастает, с ними связаны определенные надежды более глубокого понимания физиологии печени, а также диагностики и лечения патологических процессов [5, 10, 11].
Цель работы — исследование количественно-качественных изменений популяции звездчатых клеток печени крыс Вистар в онтогенезе.
Материал и методы исследования
Проведен сравнительный анализ популяции звездчатых клеток печени у 38 крыс-самцов Вистар массой тела от 110 до 480 г 4-х возрастных групп: 4, 9, 12 и 24 мес. (10, 10, 9 и 9 животных соответственно). На всех этапах были учтены Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977).
Образцы печени фиксировали в 4 %-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2-7,4); парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию. Полутонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000B (Германия). Ультратонкие срезы, контрастированные уранилацетатом и цитратом свинца, исследовали в электронном микроскопе «JEM 1010» при ускоряющем напряжении 80 кВт.
Стереологический анализ образцов печени проводили на электронограммах с использованием методов, основанных на подсчете числа пересечений тестовой линии с ее границами [2]. Ультраструктурный стереологический анализ включал определение поверхностной плотности цитоплазматических органелл звездчатых клеток. Тестовая система состояла из циклоидов суммарной длиной 45 мкм и 70 тестовых точек [8]. При статистической обработке данных применяли критерий Стьюдента; различия сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки P была меньше 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В образцах печени звездчатые клетки были хорошо видны лишь на полутонких и ультратонких срезах и дифференцировались в пространствах Диссе по наличию в цитоплазме крупных липидных капель. При электронно-микроскопическом исследовании печени 4-месячных крыс Вистар звездчатые клетки содержали немногочисленные крупные электронно-прозрачные или умеренно осмиофильные липидные капли, вместе с округлым эухромным ядром занимающие почти всю цитоплазму. Перинуклеарно, между липидными капелями, локализовалось минимальное количество мембранных органелл — одиночные мелкие митохондрии с плотным матриксом и редкими кристами и короткие профили гранулярной цитоплазматической сети.
В ультраструктурной организации гепатоцитов крыс данной возрастной группы обращало на себя внимание множество розеток гликогена. Среди цитоплазматических органелл наиболее многочисленны митохондрии, компактно группирующиеся в различных участках цитоплазмы, характеризующиеся большим числом, мелкими размерами и достаточно осмиофильным матриксом, что свидетельствовало в пользу пролиферации митохондрий. В гепатоцитах слабо представлены элементы гранулярной цитоплазматической сети, преобладали свободные рибосомы и полисомы, значительно гиперплазированы микроворсинки синусоидального полюса. В целом, комплекс ультраструктурных особенностей соответствовал ювенильному фенотипу.
В печени крыс в возрасте 9 и 12 мес. сохранялось большое содержание гликогена, нарастающее в порто-центральном направлении, при этом отмечены различной степени выраженности эозинофилия цитоплазмы части гепатоцитов и умеренная мононуклеарная инфильтрация портальных трактов. На полутонких срезах обнаружена очаговая метахромазия межклеточного матрикса, отражающая ремоделирование соединительной ткани в динамике онтогенеза.
У крыс Вистар в возрастной группе 9 мес. наиболее четко выявлялся зональный полиморфизм звездчатых клеток. Он выражался в наибольшей численной плотности липоцитов в перипортальной зоне печеночной дольки с постепенным ее уменьшением и почти полным отсутствием в перицентральных зонах. При электронно-микроскопическом исследовании центролобулярные и перицентральные звездчатые клетки содержали очень мелкие немногочисленные липидные включения, иногда с признаками деградации. Вокруг центральных вен выявлялись лишь фибробластоподобные клетки, своим ультраструктурным фенотипом не отличающиеся от клеток, продуцирующих компоненты внеклеточного матрикса непосредственно в стенке центральных вен.
В возрасте 12 мес. приблизительно четверть центролобулярной популяции звездчатых клеток печени приобретала переходный фенотип с увеличением площади цитоплазмы и одновременным присутствием и крупных липидных включений, и более развитого белоксинтезирующего компартмента. Деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом с последующей элиминацией экзоцитозом. Перинуклеарно локализовались канальцы гранулярной цитоплазматической сети и приуроченные к ним мелкие митохондрии, в ядрах формировались крупные ядрышки, что свидетельствовало об индукции синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса, ремоделирующих пространства Диссе.
В данной возрастной группе при электронно-микроскопическом исследовании выявлены признаки дегенеративно-дистрофических процессов в паренхиматозных клетках печени: многочисленные гранулы липофусцина (маркер гипоксии и/или старения клеток), гетерогенные лизосомы и полиморфные резидуальные тельца. Митохондрии были многочисленны, но приобретали более крупные размеры и полиморфизм; матрикс митохондрий менее осмиофилен; кристы редкие, очень тонкие, хаотично ориентированные. Отмечалась гетерогенность гепатоцитов по наличию фокусов внутриклеточной регенерации (скоплений параллельных профилей гранулярной цитоплазматической сети в ассоциации с митохондриями).
Печень крыс в возрасте 24 мес. характеризовалась умеренно выраженной дискомплексацией печеночных трабекул и полиморфизмом паренхиматозных клеток: неравномерным включением гликогена в пределах долек, ацидофильной и липидной дегенерацией перипортальных и перицентральных гепатоцитов, опустошенностью цитоплазмы части гепатоцитов. Наблюдались фиброз центральных вен и неравномерное расширение преимущественно перицентральных синусоидов.
При ультраструктурном исследовании выявлено ремоделирование пространств Диссе с очаговым развитием перигепатоцеллюлярного фиброза — с коллагеновыми фибриллами, локализованными также вдоль латеральных полюсов гепатоцитов. Возрастающее количество фибриллярных структур обусловливало формирование базальной мембраны эндотелиоцитов («капилляризацию» синусоидов) с изменением фенотипа микрососудистой выстилки: эндотелиальные клетки утрачивали фенестры и содержали лишь единичные пиноцитозные везикулы.
Звездчатые клетки печени у крыс в возрасте 24 мес. характеризовались значительной гетерогенностью ультраструктурной организации: среди них липидосодержащие и фиброгенные клетки, при этом большинство популяции звездчатых клеток имело переходный фенотип. Наряду с крупными липидными каплями видны свободные рибосомы и мембранные органеллы — митохондрии, элементы гранулярной и гладкой цитоплазматической сети, везикулы комплекса Гольджи, а также резидуальные структуры, отражающие процесс фокальной внутриклеточной деградации. Отмечено появление двуядерных звездчатых клеток.
В паренхиматозных клетках печени крыс в возрасте 24 мес. обнаруживалась полиморфная липидная инфильтрация, сниженное содержание гликогена, формирование аутофагосом и многочисленных резидуальных телец. Митохондрии уменьшены в количестве, крупные, с единичными кристами и гомогенным, умеренно электронно-плотным матриксом, с мелкими осмиофильными гранулами, патогномоничными для гипоксии и интоксикаций различного генеза.
Стереологический анализ ультраструктурной организации звездчатых клеток печени крыс в онтогенезе продемонстрировал уменьшение поверхностной плотности липидных включений, имеющее достоверные отличия (р
Источник