Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 1: крысы
Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии,
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор,
А.А. Зуева, токсиколог
АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»,
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245
Резюме
Установление корректных референсных интервалов для лабораторных показателей актуально как в клинической практике, так и при проведении исследований на животных. Проведен ретроспективный анализ данных по 11 биохимическим показателям сыворотки крови крыс на большой выборке животных (196 самцов и 184 самки крыс, в возрасте 12–20 нед, массой 250–350 г).
Установлено, что в крови крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), выбросы других показателей, существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при планировании исследований, что требует увеличения числа повторностей при проведении анализа показателей.
Установлены референсные интервалы для креатинина, мочевины, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глюкозы и общего билирубина. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (более 30%) установлена для таких показателей, как активность щелочной фосфатазы, уровень триглицеридов, глюкозы и общего билирубина.
Проведено сравнение полученных в ходе ретроспективного анализа данных с референсными интервалами биохимических показателей крови крыс различных линий из 3 крупных питомников (Charles River, Taconic и Envigo). Представленные в литературе референсные интервалы также свидетельствуют о высокой вариабельности активности ряда ферментов (в том числе щелочной фосфатазы), а также концентрации глюкозы, общего билирубина и триглицеридов в крови крыс. Рассчитанные нами референсные интервалы хорошо сопоставимы с данными, представленными в литературе.
Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительном использовании именно ретроспективного анализа данных, который позволяет получить более корректные референсные интервалы на большей выборке животных, без ущерба для этических принципов. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови крыс и человека демонстрирует наличие видовых различий, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.
Введение
Биохимический анализ крови – неотъемлемая часть доклинических исследований, проводимых на лабораторных животных. В большинстве случаев дизайн эксперимента предусматривает сравнение показателей животных из интактных и подопытных групп. Число животных в группе, как правило, не превышает 10, что, с точки зрения статистики, является малой выборкой [1]. Для заключения о наличии/отсутствии клинической значимости наблюдаемых отклонений необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов (РИ).
В клинической практике применяют несколько способов установления РИ. Классический подход – формирование референсной группы с применением строгих правил включения и исключения, обследование и последующий расчет РИ. Это является трудоемким и дорогостоящим процессом для медицинских учреждений, а в доклинических исследованиях еще и противоречит нормам биоэтики, так как для установления РИ в каждой половой или возрастной группе требуется не менее 120 наблюдений [2, 4]. Другой подход – апостериорный (ретроспективный) – позволяет использовать для расчета РИ результаты, ранее полученные в данной лаборатории, за определенный период времени. Также на практике прибегают к данным в справочной литературе, что в доклинических исследованиях оправдано при анализе новых или редко используемых показателей или экзотических видов лабораторных животных.
В связи с изложенным, цель нашей работы – установление референсных интервалов для основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и оценка частоты статистических выбросов для этих показателей. Для установления РИ был выбран ретроспективный метод, что позволило включить в массив данных большое число животных, не нарушая при этом биоэтические принципы. Крысы являются одним из самых востребованных тест-систем. Поэтому мы рассматриваем вопрос установления РИ биохимических показателей на примере этих животных.
Материал и методы
Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в период проведения текущих исследований с октября 2018 по октябрь 2019 г. В массив данных включали животных интактных групп из 26 исследований, возраст самцов и самок аутбредных крыс составлял 12–20 нед, масса тела – 250–350 г (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). В сформированном массиве находились данные, полученные ранее от 196 самцов и 184 самок крыс. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Испания) были рассчитаны следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов Вектор-Бест (Россия), остальные аналиты – с помощью наборов Bio Systems (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна Уитни и t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5•IQR)-(Q3+1,5•IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.
После исключения выбросов массивы данных были проанализированы на соответствие действующим в центре РИ. Последние были рассчитаны с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (20 голов – 10 самцов и 10 самок). Данные о доле статистических выбросов, в том числе «extremes», по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.
Доли статистических выбросов и отклонений от действующих РИ
Источник
Щелочная фосфатаза у крыс
Биохимические изменения в организме при травме костей и, в частности, альвеолярной кости освещены в ряде работ различного времени с точки зрения патогенеза, диагностики, эффективности лечения [1, 3, 4, 9], а не с точки зрения разработки прогностических критериев исходов травматического повреждения костей с целью своевременной коррекции возможных осложнений. Если учесть, что травма в клинике возникает в большинстве случаев на фоне других заболеваний, нарушенной реактивности, в том числе метаболического характера, становится очевидным, что разработка таких критериев должна начинаться с эксперимента. Следует отметить, что изучение биохимических показателей обычно привязывается к подтверждению воспроизведенных в эксперименте нарушений костной системы [3] без учета стадийности репаративного остеогенеза. Видимо, поэтому исследователи не находят ожидаемых изменений в определенный отрезок времени.
Целью нашего исследования явилось сравнительное изучение кинетики классических биохимических критериев травмы кости (кальций, фосфор, щелочная фосфатаза) и современных показателей повреждения и заживления (провоспалительные цитокины) на моделях посттравматической регенерации альвеолярной кости у крыс. Для реализации цели исследования стандартное травматическое повреждение альвеолярной кости наносили двум группам крыс: без костной патологии и с остеопорозом.
Материалы и методы исследования
Эксперимент проведен на 70 половозрелых крысах-самцах линии WAG. Животные были разделены на 4 группы: группа 1 – интактные; группа 2 – остеопороз, вызванный введением дексаметазона из расчета 1,675 мг/кг 1 раз в сутки внутримышечно в течение 2 недель [11]; группе 3 и 4 наносили травматическое повреждение нижней челюсти в виде перфорационного (сквозного дырчатого) дефекта диаметром 2 мм [7]. До проведения операции группе 3 вводили внутримышечно физиологический раствор в объеме, эквивалентном раствору дексаметазона, ежедневно в течение 2-х недель, группе 4 – дексаметазон в дозе 1,675 мг/кг ежедневно внутримышечно в течение 2-х недель. Оперативное вмешательство осуществляли под общим наркозом (аминазин 10 мг/кг, кетамин 50 мг/кг) в условиях асептики и антисептики. Крыс 3-й и 4-й групп выводили из эксперимента на 7, 14, 28 и 45 сутки после травмы с соблюдением требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для исследовательских и других научных целей. Сроки исследования были выбраны соответственно стадийности репаративного остеогенеза у крыс [5].
Для определения кальция и фосфора применяли фотометрические методы с использованием коммерческих наборов фирмы Филисит-Диагностика (Украина). Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли кинетическим методом с р-нитрофенолфосфатом. Содержание ИЛ-1α и ИЛ-8 в периферической крови определяли иммуноферментными методами на иммуноферментном анализаторе «Labline-90» (Австрия) согласно прилагаемой инструкции.
Результаты исследований обрабатывали стандартными методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием прикладных программ «Stadiа-6» [2].
Результаты исследования и их обсуждение
Доказательства нарушений альвеолярной кости остеопоретического характера, возникших под влиянием двухнедельного введения дексаметазона, приведены в наших ранних работах [6, 7]. При этом обнаружены сдвиги в активности ЩФ, уровне метаболитов оксида азота при неизмененном содержании Са и Р в крови. Некоторые из этих данных отражены в табл. 1–3 (группа 2, остеопороз).
Как следует из данных, представленных в табл. 1, направленность изменений содержания кальция в сыворотке крови животных 3 и 4 групп после травмы однотипна. Однако при этом на 7 сутки содержание кальция в крови животных 3 группы (травма нижней челюсти) не изменяется, а в 4 группе (травма нижней челюсти на фоне остеопороза) достоверно нарастает в сравнении с интактными животными, видимо, за счет большого масштаба разрушений кости под влиянием дексаметазона.
На 14 сутки содержание кальция в обеих группах достоверно снижается по сравнению с интактными крысами, скорее всего, за счет минерализации, отмеченной в этой стадии репаративного остеогенеза [5]; оно остается сниженным и на 28 сутки в обеих группах, однако повышается по сравнению с 14 сутками (табл. 1). На 45 сутки концентрация кальция в крови в обеих группах вновь нарастает как в сравнении с нормой, так и относительно предыдущего срока (28 сутки), видимо, в связи с резорбцией избыточного регенерата на стадии ремоделирования костного регенерата [9]. Обращает на себя внимание тот факт, что ни в одном из сроков наблюдений достоверных отличий в содержании кальция в крови между 3 и 4 группами не выявлено.
Содержание кальция (ммоль/л) в сыворотке крови крыс после травмы альвеолярной кости
Источник
Щелочная фосфатаза у крыс
Проблема лечения гепатитов различной этиологии является чрезвычайно актуальной. Несмотря на большой арсенал гепатопротекторов, клиницистам не всегда удается добиться стабилизации течения гепатита, повышения регенераторной активности и предотвращения развития фиброза и цирроза печени [8]. В связи с этим продолжаются поиски новых лекарственных агентов, в том числе и растительного происхождения, обладающих широким спектром фармакологической активности и экономической доступностью. Объектом нашего внимания длительное время является производное бетулоновой кислоты — ее аланинамид (АБК). Ранее нами было показано, что этот агент обладает антиоксидантным, противоопухолевым, гемато-, кардио-, нефро- и гепатопротекторным действием в условиях цитостатического воздействия [1-6, 9]. Кроме того, на модели острого токсического гепатита было показано, что введение животным АБК способствует нормализации биохимических показателей крови [10, 11]. Поэтому для дальнейшего расширения фармакологического спектра действия данного агента проведены исследования его влияния на процессы фиброгенеза и формирования цирроза печени в длительном эксперименте.
Цель работы — изучение влияния АБК на биохимические показатели крови, популяционную динамику гепатоцитов и морфологию печени крыс при хроническом токсическом поражении четыреххлористым углеродом в сочетании с этанолом.
Материал и методы исследования
Эксперимент выполнен на 45 белых лабораторных крысах-самках массой 178 г, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), содержавшихся в стандартных условиях на обычном пищевом и водном рационе. Манипуляции с животными проводились согласно Женевской Конвенции 1986 г.
Токсические повреждения печени моделировали путем внутрижелудочного введения четыреххлористого углерода (CCl4) в дозе 0,1 мл/кг в растворе растительного масла (0,3 мл/100 г) трижды в неделю, в сочетании с 5%-м раствором этанола в качестве питья в свободном доступе на протяжении 6 нед. Все животные были разделены на 3 группы по 15 особей в каждой. Животные I группы получали только CCl4 и этанол; крысы II группы — те же токсические агенты и АБК в дозе 50 мг/кг в водно-твиновом растворе, который вводили ежедневно внутрижелудочно со 2-й по 6-ю неделю эксперимента включительно (две последующие недели были восстановительным периодом); III группа — интактные животные. Из опыта крыс выводили декапитацией через 3, 6 и 8 нед. В сыворотке крови определяли активность АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ, уровень общего белка, прямого билирубина и глюкозы.
Для оценки популяции гепатоцитов была проведена щелочная диссоциация печени [3]. Клеточную суспензию окрашивали 30 мин 1%-м раствором орсеина на 70%-й уксусной кислоте, разводили дистиллированной водой до концентрации 5 мг/мл. Подсчет ядер гепатоцитов из одного образца ткани проводили в 6 последовательно заполняемых суспензией камерах Горяева. Рассчитывали число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани (n), абсолютное число гепатоцитов (М), индекс двуядерных гепатоцитов (M2/M·100).
Для гистологического исследования образцы печени заключали в парафин по общепринятой методике, изготавливали парафиновые срезы толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином на гистологическом комплексе «MICROM» (Карл Цейс) и по методу Маллори. Исследование проводили с помощью микроскопа Axioskop 40.
Количественные данные обрабатывали методами параметрической статистики с использованием пакета программ «Microsoft Excel». Результаты считали достоверными при p *
Источник