Способы изучения стресса у крыс
Вопрос целенаправленного формирования и поддержания здоровья организма человека в условиях возрастающих изменений окружающей среды и образа жизни современного общества следует отнести к разряду первостепенных [1, 2]. Стрессовые ситуации – постоянные спутники человеческой жизни. Стресс-реакция является адаптивным механизмом, направленным на поддержание стабильности физического и психического функционирования организма в ответ на воздействие стрессора 5. Однако стресс не всегда является адаптивной реакцией. Некоторые физиологические реакции стресса являются полезными на протяжении короткого времени и неблагоприятными в долгосрочной перспективе [6, 7]. В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось изучение влияния эмоционального стресса и прерывистой гипоксии на поведенческие реакции крыс.
Материал и методы исследования. Работа выполнена в рамках международного проекта «Изучение гематоксического влияния тяжелых металлов и возможности активации защитно-приспособительных механизмов организма при помощи нормо- и гипобарической гипоксии у взрослых и старых животных в сравнении» (научный руководитель проф. А.А. Аканов) при финансовой поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан
Эксперименты выполнены на 40 белых крысах-самцах массой 180-220 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе. Проведены 4 серии экспериментов: 1 серия – молодые интактные животные (контроль); 2 серия – молодые животные, подвергавшиеся иммобилизационному стрессу; 3 серия – молодые интактные животные (контроль); 4 серия – молодые животные, подвергавшиеся воздействию нормобарической гипоксии. В каждой серии было по 10 животных. Воздействие нормобарической гипоксии продолжали в течение 21 суток экспозицией один час. Модель нормобарической гипоксии создавали при помощи гипоксикатора, дозирующего поступление атмосферного воздуха с 10 % содержанием кислорода. Для этого гипоксикатор присоединяли шлангом к баллону с азотом, второй шланг присоединяли с ящиком (с выходным вентилляционным отверстием) куда помещали опытных животных. Объем ящика был специально рассчитан на количество помещаемых крыс. Иммобилизационный стресс моделировали при помощи пластиковой камеры, ограничивающей движение, куда помещали животное ежедневно по 30 мин. в течение недели. Изучение поведенческих реакций опытных крыс проводилось в тесте «открытого поля». Исследования проводились с соблюдением норм и правил проведения экспериментов с участием животных (решение ЛЭК КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова протокол №2 от 18.04.2013 г.).
Процедуры статистического анализа выполнялись с помощью ППП SPSS-16. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05, либо 0,1. В случае превышения достигнутого уровня значимости статистического критерия этой величины, принималась нулевая гипотеза.
Результаты и обсуждение. Оценку эмоционального состояния, двигательную и исследовательскую активность экспериментальных животных изучали по характеру их поведения в тесте «открытого поля». В качестве поведенческих феноменов в открытом поле регистрировали горизонтальную двигательную активность по количеству пересеченных квадратов, вертикальную активность по числу подъемов на задние лапы с опорой и без опоры, эмоциональный статус по количеству дефекационных болюсов и умываний, исследовательский интерес по количеству актов «обнюхи-ваний».
В первом опытном сеансе под воздействием стресса у молодых крыс по сравнению с интактными животными статистически значимо сокращалось время первого передвижения (z=-2,226, р=0,026) (табл. 1).
Основные статистические показатели поведенческих реакций молодых интактных крыс
в тесте «открытого поля», подвергавшихся иммобилизационному стрессу
Источник
Российские ученые запатентовали способ моделирования стрессового расстройства крыс
В течение семи лет в Южно-Уральском государственном университете ведутся исследования, позволяющие ученым приблизиться к поиску эффективной терапии для пациентов с комплексным ПТСР. И проблемы, которые сопровождают ПТСР, и эффективность лекарственных препаратов исследователи проверяют в результате экспериментов на крысах.
Учеными Международной лаборатории нейрогепатологии ЮУрГУ разработана экспериментальная модель, которая позволяет воспроизвести комплексный ПТСР. Ее особенность в том, что на крыс в течение 10 дней на протяжении 10 минут воздействовали кошачьей уриной. Ученые ЮУрГУ первыми пошли по пути хронизации для формирования стрессовой обстановки. Изобретение получило патент «Способ моделирования посттравматического стрессового расстройства у лабораторных крыс».
В постстрессовый период исследователи определили концентрацию кортикостерона в крови, концентрацию гамма-аминомасляной кислоты, МАО-А, содержание норадреналина в головном мозге.
«Эта модель позволяет отследить не только поведенческие расстройства и уровень тревожности, но и рассмотреть поражения внутренних органов, сопровождающих ПТСР. Для нас было большим сюрпризом открытие, что у пациентов с этим диагнозом имеет место надпочечная недостаточность и нарушение работы сердечно-сосудистой системы. Ранее ни одна модель не отражала такой зависимости», — рассказал один из авторов патента д.б.н., директор Высшей медико-биологической школы ЮУрГУ Вадим Цейликман.
Модель уже зарекомендовала себя в университетах России, Белоруссии и Словакии. В будущем коллеги из других городов и стран смогут пользоваться моделью при проведении исследований совместно с учеными ЮУрГУ. По словам Вадима Цейликмана, исследователи заинтересованы в том, чтобы их изобретение получило широкое распространение.
Южно-Уральский государственный университет (ЮУрГУ) — это университет цифровых трансформаций, где ведутся инновационные исследования по большинству приоритетных направлений развития науки и техники. В соответствии со стратегией научно-технологического развития РФ университет сфокусирован на развитии крупных научных междисциплинарных проектов в области цифровой индустрии, материаловедения и экологии. В Год науки и технологий ЮУрГУ примет участие в конкурсе по программе «Приоритет-2030». Вуз выполняет функции регионального проектного офиса Уральского межрегионального научно-образовательного центра мирового уровня (УМНОЦ).
Пресс-релиз предоставлен управлением медиакоммуникаций и мониторинга ЮУрГУ
Источник
Способы изучения стресса у крыс
У инфантильных крыс как сосудистый, так и хронотропный эффекты стресса более выражены по своей интенсивности, чем у половозрелых особей, что свидетельствует, во-первых, о неэкономном режиме функционирования сердечно-сосудистой системы (ССС) при стрессе на ранних этапах онтогенеза, и во-вторых, о совершенствовании механизмов адаптации ССС к стрессу с возрастом. У старых крыс по сравнению с половозрелыми самцами отмечается миокардиальная рефрактерность к стрессу на фоне усиления гипертензивных реакций, что рядом авторов [8, 12] рассматривается как проявление стрессорной дезадаптации ССС на поздних этапах онтогенеза.
В наших предыдущих работах было показано, что изменения базального уровня артериального давления (АД) в онтогенезе сопряжены с возрастными особенностями устойчивости к развитию артериальной гипертензии (АГ) [1]. Повышенные показатели АД, наблюдаемые у инфантильных, и особенно, у старых крыс по сравнению с половозрелыми особями, сочетаются со сниженной устойчивостью к развитию АГ, что свидетельствует об узком диапазоне приспособительных возможностей ССС на начальных и поздних этапах онтогенеза.
Механизмы возрастных особенностей устойчивости к развитию АГ мало изучены. В настоящее время активно обсуждается вопрос о возрастных изменениях в кардиоваскулярной стресс-реактивности как об общем неспецифическом проявлении адаптационных и резервных возможностей ССС [8, 12]. В частности, существует предположение, что возрастные изменения в кардиоваскулярной стресс-реактивности являются прямым отражением устойчивости к развитию сосудистых заболеваний, включая АГ [10, 11].
Важно отметить, что исследования в этой области крайне малочисленны и носят, в основном, феноменологический характер без системного изучения механизмов, лежащих в основе возрастных особенностей кардиоваскулярной чувствительности к стрессу и устойчивости к развитию АГ. Для решения указанной проблемы были проведены эксперименты по изучению изменений в онтогенезе кардиоваскулярной стресс-реактивности.
Цель работы – изучение возрастных особенностей структуры кардиоваскулярной стресс-реактивности.
Материалы и методы исследования
Исследования выполнены на 29 самцах белых беспородных крыс. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Регистрацию гемодинамических параметров – среднего артериального давления (ср.АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС) у бодрствующих крыс осуществляли на компьютерно-вычислительном комплексе для прямой регистрации кровяного давления у мелких животных (PowerLab/400 ML 401, ID Instruments, 2002, Австралия) с программным обеспечением Chart 4, оснащенным датчиками кровяного давления (MLT0699, PowerLab, ID Instruments). С этой целью за сутки до экспериментов животным вживлялся полиэтиленовый катетер в аорту через левую ветвь сонной артерии под общей нембуталовой анестезией (0,40 мг/кг, ip). Кардиоваскулярная стресс-реактивность изучалась у инфантильных (n = 9, 6-недельный возраст, масса 50–70 г) и старых (n = 10, 24–30-месячный возраст, масса 340–380 р.) крыс по сравнению с половозрелыми особями (n = 10, 5-7-месячный возраст, 220-270 г) в условиях 60-минутного иммобилизацинного стресса.
Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью пакета программ Statistica 5.0. Различия считались достоверными при р
Источник
Способы изучения стресса у крыс
УДК 611.813.14.018: 599.323.4
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВЕДЕНИЯ У ПРЕДПОЧИТАЮЩИХ АЛКОГОЛЬ КРЫС В УСТАНОВКЕ «ПРИПОДНЯТЫЙ КРЕСТООБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ» И СОДЕРЖАНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ СТРЕССОРА
Леушкина Н. Ф., Федорова А. М., Ахмадеев А. В.
ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет Минобрнауки РФ», Уфа, Россия (450076, Уфа, ул.Заки Валиди, 32) e-mail: mpha@ufanet.ru
Объектом исследования были крысы линии WAG/Rij с генотипом А1/А1 по локусу Taq 1A гена Д2-рецептора, прошедшие селекцию на предпочтение алкоголя. В качестве стрессора использовали пятикратную ежедневную аудиогенную стимуляцию. Стресс значимо увеличил время пребывания крыс в закрытом рукаве лабиринта, а также длительность и количество эпизодов груминга, что свидетельствует о формировании у них тревожности. Сопоставление результатов тестирования поведения крыс в приподнятом крестообразном лабиринте с ранее выявленными сдвигами в поведенческих реакциях в установке «открытое поле» позволяет указать на присущую этим крысам особенность. Она заключается в том, что тревожность проявляется формированием активной стратегии поведения. После действия стрессорных нагрузок содержание дофамина в МК (повышенное до стресса) снижается на 33 %. В отличие от дофамина, в ответ на стресс содержание норадреналина увеличивается на 17 %. Выявленные нейробиологические особенности представляют интерес для исследования механизмов формирования девиантного поведения.
Ключевые слова: предрасположенность к алкоголизму, стресс, миндалевидный комплекс, катехоламины.
CHARACTERIZATION OF THE BEHAVIOR OF THE ALCOHOL-PREFERRING RATS IN THE INSTALLATION «ELEVATED PLUS MAZE» AND THE CONTENT OF CATECHOLAMINES AFTER EXPOSURE TO THE STRESSOR
Leushkina N. F., Fedorova A. M., Akhmadeev A. V.
Bashkir state University, Ufa, Russia (450076, Ufa, st. Zaki Validi, 32), e-mail: mpha@ufanet.ru
The object of the study were WAG/Rij rats with genotype A1/A1 on the locus Taq 1A gene D2 receptor after breeding on the preference of alcohol. As a stressor used five times daily audiogenic stimulation. Stress significantly increased the time of stay of rats in the dark compartment of labyrinth, as well as the duration and the number of episodes of grooming, that testifies to the formation of their anxiety. Comparison of the results of testing the behavior of rats in the “elevated plus maze” with a previously identified shifts in behavior in «open field» allows you to point to the inherent feature of these rats. It lies in the fact that anxiety is manifested formation of the active strategy of behavior. After exposure to stress loads content of dopamine in the Amygdala (high to stress) is reduced by 33 %. Unlike dopamine, in response to stress the content of norepinephrine increases by 17 %. Identified neurobiological features are of interest to study the mechanisms of formation of deviant behavior.
Key words: predisposition to alcoholism, stress, Amygdala, catecholamines.
Стресс, вызывая нарушения в деятельности ведущих регуляторных систем организма – нервной, эндокринной и иммунной, приводит к тому, что имеющая место в организме предрасположенность к заболеванию проявляется, происходит формирование болезни. Это общая закономерность находит выражение и при болезнях зависимости, к которым относится и алкоголизм.
К настоящему времени уже установлены основные биологические механизмы развития болезней зависимости от психоактивных веществ (ПАВ). Они указывают на ведущую роль катехоламиновой системы в ее патогенезе [2, 5]. Показано, что повышение уровня катехоламинов связано с актуализацией патологического влечения к психоактивным веществам и предопределено на 50 процентов генетическими факторами.
Первое экспериментальное подтверждение роли полиморфизма локуса Taq 1A DRD2 в развитии алкогольной зависимости получено на молекулярно-генетических моделях – крысах, имеющих различия в аллельной структуре указанного локуса, которые были выявлены после генетического анализа и к моменту эксперимента прошли 20 поколений [3]. Крысы с генотипом А1/А1 по локусу Taq 1A DRD2, показавшие ускоренные темпы формирования толерантности и психической зависимости по сравнению с крысами с генотипом А2/А2 в эксперименте с принудительной алкоголизацией, являются валидной моделью для исследования факторов, определяющих предрасположенность к ПАВ.
Биологические механизмы влияния стресса на манифестацию алкоголизма изучены недостаточно, а результаты выполненных работ противоречивы. Lynch et al. [14] показали, что иммобилизационный стресс увеличивает потребление алкоголя крысами линии Вистар, а Chester et al. [8], наоборот, наблюдали снижение потребление алкоголя предпочитающими алкоголь (ПА) крысами в процессе стрессогенных процедур. Повторные сеансы стрессорных воздействий (плавательный тест) приводили к увеличению потребления алкоголя только у крыс линии Вистар, но не у ПА крыс [7]. Существующие в литературе противоречия объясняются использованием различных линий животных, особенностями проведения экспериментальных процедур, но важную роль при этом играют, несомненно, и генетические факторы, которые у животных моделей, созданных на основании фенотипического признака – склонности к потреблению алкоголя – остаются неизвестными.
Целью работы являлся анализ поведения предпочитающих алкоголь крыс в установке приподнятый крестообразный лабиринт и содержания катехоламинов в миндалевидном комплексе мозга (МК) после действия стрессора.
Материал и методы исследования. Использованные в работе предпочитающие алкоголь (ПА) крысы (всего 10, самцы и самки) получены из популяции крыс линии WAG/Rij после генотипирования локуса Taq 1A DRD2, скрещивания гомозиготных животных и выявления в последующем предпочтения алкоголя в тесте двух поилок [4]. Среди крыс, имевших генотип А1/А1, для получения потомства (которое использовано для проведения данной работы) были отобраны особи (самки и самцы), имевшие высокие темпы нарастания количеств потребляемого спирта при принудительной алкоголизации в течение двух недель и с установкой двух поилок на третьей неделе эксперимента предпочитавшие пить спирт. В настоящем исследовании использовано четвертое поколение ПА крыс.
Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ), использованный в работе, представлял собой установку, имеющую два рукава, в месте пересечения которых находилась открытая площадка. Один из рукавов лабиринта имел закрытые отсеки. Лабиринт устанавливали на высоте одного метра от пола. Мы регистрировали время нахождения крысы в открытом (ОР) и закрытом (ЗР) рукавах лабиринта, количество стоек в ОР и ЗР рукавах, латентный период до первого движения, общую неподвижность в ОР и ЗР рукавах, количество свешиваний в ОР, количество заходов в ОР и ЗР.
Эксперимент, направленный на выяснение действия стрессорных нагрузок на ПА и НА крыс, проводился в три этапа: 1 этап – тестирование поведения животных в ПКЛ в течение 5 дней; 2 этап – пятикратное в течение пяти дней воздействие стрессора; 3 этап – повторное тестирование поведенческих реакций животных в ПКЛ в течение 5 дней. В качестве стрессора использовали пятикратную ежедневную аудиогенную стимуляцию, которая проводилась в специальной камере (60x60x60см) по методике Кузнецовой [6], используя «звон ключей» («keys ringing»).
Содержание биогенных аминов и их метаболитов в МК (по 10 крыс до и после стресса, самцы и самки) определяли на ВЭЖХ (Аквилон, Россия) со спектрофотометрическим детектором (UVV-104 M). Область МК выделяли из нативного мозга и гомогенизировали в 20 объемах холодной 0,1М перхлорной кислоты (Sigma, USA) и 1пг/50 мкл дигидроксибензиламина гидробромида (Sigma, USA) в качестве внутреннего стандарта. Гомогенизат центрифугировали (при -20оС) в течение десяти минут при 6000 оборотов в минуту. Супернатант подвергали микрофильтрации с помощью специальных наборов фирмы «Биохром» (Россия). После повторного центрифугирования пробы анализировали на содержание моноаминов (норадреналина, дофамина) и метаболита дофамина – 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК). Полученные результаты систематизировали и подвергали статистической обработке с помощью пакета программ «Statistica 6».
Результаты исследований и их обсуждение. В ранее проведенном исследовании поведения ПА крыс в «открытом поле» (ОП) было обнаружено, что для них характерна выраженная двигательная активность. При этом крысы больше двигались в периферической зоне ОП, что позволяло предполагать наличие большей тревожности. На это указывали и данные регистрации груминга. Изучение двигательной активности крыс в ОП, после стресса, показало, что она увеличивается [1]. Обращало на себя внимание и изменение перемещения крыс по разным секторам поля. Если до стресса крысы двигались преимущественно по периферии поля (что стало одним из оснований для предположения, что им свойственна тревожность), после стресса они стали, не только более активно перемещаться, но и больше выходить в центральные (в 1,3 раза) и промежуточные сектора (1,2 раза) ОП. Является ли увеличение горизонтальной активности крыс в ОП, после стресса, отражением формирующейся у них тревожности мы решили выяснить с использованием установки ПКЛ, который является наиболее признанным тестом при оценке уровня тревожности у грызунов. Полученные результаты отражены в таблице.
Таблица. Показатели поведения предпочитающих алкоголь крыс до и после стресса (M+m) в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ)
Время пребывания в закрытом рукаве (с)
Время пребывания в открытом рукаве (с)
Длительность груминга в закрытом рукаве (с)
Количество эпизодов груминга в закрытом рукаве
Источник